Isolatie van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen voor In Vitro Decidualization
Summary
Deze studie geeft een gevalideerde en geoptimaliseerde procedure voor de isolatie en de cultuur van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen uit te voeren in vitro decidualization assay. Verder biedt deze studie een gedetailleerde methode om efficiënt vechtpartij een specifiek gen siRNAs, waarbij in menselijk baarmoederslijmvlies stromale cellen.
Abstract
De differentiatie van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen (HESC) van de fibroblast-achtige verschijning in secretoire decidua is een transformatie die nodig is voor de innesteling van het embryo in het baarmoederslijmvlies van de moeders schoot. Onjuiste decidualization is opgezet als een oorzaak voor implantatie falen en de daaropvolgende vroege embryo miskraam. Daarom is het voordeel aan de verbetering van het tarief van succesvolle geboorten inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de decidualization. In vivo gebaseerd studies van kunstmatige decidualization beperken vaak als gevolg van ethische dilemma’s gekoppeld aan menselijk onderzoek, evenals translationeel complicaties in diermodellen. Dientengevolge, worden in vitro testen door middel van primaire celculturen vaak gebruikt om de modulering van de decidualization verkennen via hormonen. Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor de isolatie van HESC en latere kunstmatige decidualization via de suppletie van hormonen aan het kweken medium. Verder, deze studie biedt een goed ontworpen methode om knockdown elk gen van belang met behulp van siRNA lipide-gebaseerde transfections. Dit protocol staat de optimalisatie van cultuur zuiverheid, alsmede product rendement, waardoor het maximaliseren van de mogelijkheid om gebruik te maken van dit model als een betrouwbare methode om te begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de decidualization, en de daaropvolgende kwantificering van secreted agenten door decidualized baarmoederslijmvlies stromale cellen.
Introduction
Tussen de fasen van menarche en menopauze ondergaan vrouwen in de reproductieve leeftijd maandelijkse cycli van hormoon-gereglementeerde endometrium-proliferatie, differentiatie en latere vergieten in voorbereiding op de zwangerschap in een proces dat bekend staat als de menstruatie1 ,2. Dergelijke fysieke wijzigingen van het menselijke endometrium zijn nodig voor de goede embryo-implantatie in de baarmoederwand1. Wijzigingen van het endometrium, met inbegrip van zowel morfologische en biochemische aanpassingen, zijn gedurende de menstruele cyclus via ovariële steroïde hormonen oestrogeen en progesteron (P4) gemedieerde3,4,5. Preovulatory oestrogeen niveaus binnen de proliferatieve (of folliculaire) fase, verhoging, initiëren verdikking van het baarmoederslijmvlies. Na de ovulatie promoot de secretoire (of luteale) fase een aanzienlijke stijging van de P4 concentraties, de morfologische transformatie van baarmoederslijmvlies stromale cellen (ESC) inducerende uit fibroblast-achtige verschijning afgerond, epitheliale-achtige decidual cellen in een proces dat bekend staat als decidualization4,6. Onjuiste decidualization is opgezet als een oorzaak voor implantatie mislukking en daaropvolgende vroege embryo miskraam4,7,8. Inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de decidualization is dus voordelig voor de diagnose en de behandeling van vroege zwangerschap verlies.
Op dit moment worden verschillende methoden gebruikt voor het verkennen van de onderliggende effecten van decidualization op baarmoederslijmvlies stromale cellen. In vivo, de muis baarmoeder kan worden kunstmatig opgewekt voor decidualization via mechanische stimulatie (dat wil zeggen,krabben) of injectie in een hormonaal primer baarmoeder-9olie. Onderscheiden van mensen, deze synthetische stimulatie bevordert de differentiatie van de uteriene lumen door het verstrekken van het uiterlijk van de blastocyst aanwezigheid, een stap die nodig is voor de opening van decidualization in knaagdieren10,11. Dienovereenkomstig, als gevolg van de translationeel complicaties geassocieerd met diermodellen en de ethische dilemma’s rond in vivo gebaseerd studies bij de mens, op basis decidualization modellen zijn met het meeste succes studeerde in vitro.
In deze studie, worden onderwerpen aangeworven door middel van de plaatsing van advertenties in zowel lokale kranten voor Engels en Spaans. Onderwerpen geïdentificeerd als geschikte kandidaten voor deze studie komen om te voldoen aan de coördinator van het onderzoek, waarin een volledige openbaarmaking van potentiële risico’s worden besproken. Na bevestiging wordt door voor een compleet begrip van de potentiële risico’s wordt onderwerpen toestemming bereikt in zowel de schriftelijke en de mondelinge vormen. Onderwerp toestemming heeft betrekking op (1) ondergaan phlebotomy (2) langdurige opslag van hun weefsels voor toekomstige onderzoeksdoeleinden en (3) akkoord gaan met de totstandbrenging van primaire culturen uit verzamelde weefsel monsters. Na toestemming, onderwerpen krijgen een formulier in te vullen in welke toegestane zelf-identificatie van ras/etniciteit en/of het recht van de geheimhoudingsplicht. Een volgend bezoek is gepland voor het bereiken van het endometrium biopsie op basis van de menstruele cyclus van het onderwerp. Vrijwilligers gerekruteerd om deze studie beide etnische en raciale demographics van de St. Louis Metropolitana weerspiegelen, zoals gedocumenteerd door de volkstelling van 2012 en de deelname van alle kwetsbare bevolking zoals zwangere vrouwen, foetussen, embryo’s, geen kinderen jonger dan 18 jaar van leeftijd, of andere kwetsbare groepen. Vereisten voor deelname aan de biopsie sample collectie opnemen (1) zijn tussen de leeftijden van 18-45 jaar (2) met regelmatige menstruatiecyclus (25-32 dagen) (3) hebben geen huidige zwangerschap of gebruik van hormonale/uteriene apparaat anticonceptiva Gelet geen huidige abnormale uitstrijkpreparaten voor 30 dagen vóór de inschrijving (4) hebben geen huidige vaginale infectie of seksueel overdraagbare aandoeningen (5) Gelet geen huidige antibiotica, en (6).
Binnen deze studie, zijn menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen (HESC) gekweekt en kunstmatig geïnduceerde ondergaan in vitro decidualization via de suppletie van hormonen (estradiol (E2), medroxyprogesteron acetaat (MPA) en cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP)) aan het medium. Bij deze methode wordt wordt de mate van decidualization gewijzigd op basis van het totale aantal dagen van hormonale behandeling. In combinatie met cytoskeletal omlegging induceert hormonale suppletie biochemische aanpassingen waarin de decidual cellen secretoire-achtige kwaliteiten2,4 ervaren. De expressie van genen van hallmark, zoals prolactine (PRL) en insuline-achtige groeifactor bindende eiwit 1 (IGFBP1), kan worden gebruikt om te bevestigen en kwantificeren van de mate van HESC decidualization5,12, 13 , 14. bovenal de levensvatbaarheid van dit protocol uit te voeren specifieke knockdown gen wordt ook aangetoond.
Protocol
Representative Results
Discussion
De vrouwelijke reproductieve menstruele cyclus wordt gekenmerkt door een stijging van progesteron niveaus gedurende de luteale fase inducerende waardoor de decidualization van ESC in ronde, epitheliale-achtige secretoire cellen3,8. De opening van decidualization is afhankelijke soorten. Bij de mens, decidualization doet zich spontaan op de opkomst van progesteron concentratie, overwegende dat muizen10,11v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
Riferimenti
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
