Method Article

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

DOI:

10.3791/57685

⸱

June 7th, 2018

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microambiente tumorale immuni (tempo) recentemente è stato riconosciuto come un mediatore critico di risposta al trattamento nei tumori solidi, soprattutto per le immunoterapie. Recenti progressi clinici nell'immunoterapia evidenziano l'esigenza di metodi riproducibili caratterizzare accuratamente e completamente il tumore e suoi associati si infiltrano in immuni. Digestione enzimatica del tumore e l'analisi cytometric di flusso permettono ampia caratterizzazione di numerosi sottoinsiemi delle cellule immuni e fenotipi; Tuttavia, profondità di analisi è spesso limitata dalla fluoroforo restrizioni sul design del pannello e la necessità di acquisire campioni di grande tumore di osservare rari popolazioni immuni di interesse. Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace e ad alta produttività per la separazione e arricchendo l'infiltrato immune tumore dai componenti del tumore non immune. La digestione di tumore descritto e separazione centrifuga basati su densità tecnica permette separato caratterizzazione del tumore e tumore immuni si infiltra in frazioni e preserva la vitalità cellulare e quindi, fornisce un'ampia caratterizzazione del tumore stato immunologico. Questo metodo è stato usato per caratterizzare la vasta eterogeneità immuni spaziale nei tumori solidi, che dimostra ulteriormente la necessità di tecniche di analisi immunologiche coerente intero tumore. Nel complesso, questo metodo fornisce una tecnica efficace ed adattabile per la caratterizzazione immunologica dei tumori murini solidi sottocutanei; come tale, questo strumento può essere utilizzato per caratterizzare meglio le caratteristiche immunologiche tumorale e nella valutazione preclinica di nuove strategie immunoterapeutiche.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tempo soppressivo recentemente è stato riconosciuto come un marchio di garanzia di cancro ed è conosciuto per svolgere un ruolo significativo nello sviluppo, progressione e nella protezione dei cancri solidi del tumore così come mitigare la loro suscettibilità all'immunoterapia1. Il tempo è composto di numerosi cellulari sottoinsiemi e fenotipi, che forniscono approfondimenti critici dello stato immunologico del tumore. Questi sottoinsiemi immunologici possono essere ulteriormente stratificati nelle cellule del linfocita o origine mieloide, che insieme costituiscono la maggior parte della risposta immunitaria innata e adattativa

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.

1. digestione e raccolto tumore

Nota: Il tempo richiesto per il raccolto è ~ 3-5 min/tumore e il tempo necessario per l'elaborazione è ~ 1 h + 2-3 min/tumore.

  1. Eutanasia di topi per inalazione di anidride carbonica e spray ogni mouse giù con etanolo al 70% prima della raccolta per evitare la contaminazione di capelli. Chirurgicamente rimuovere tumori sottocutanei dai topi e garantire che i tumori sono privi di qualsiasi tessuto contaminante (cioè, capelli, pelle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I nostri risultati dimostrano il beneficio significativo di TIL separazione da componenti del tumore non immune, come spiegato nel protocollo. Inoltre, utilizzando il metodo descritto dimostriamo la significativa eterogeneità immunologica dei tumori solidi stabiliti.

Un problema significativo con molte tecniche di dissociazione del tumore è la perdita di vitalità del campione, più spesso a causa delle condizioni difficili digest.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tempo è composto di molecole e componenti cellulari diversi e complessi. La prova recente suggerisce che accurata caratterizzazione di questo ambiente in grado di fornire una migliore comprensione del trattamento esito positivo o negativo e può anche aiutare a identificare i meccanismi di resistenza terapeutica. Ad esempio, aumentando i livelli di intratumoral di varie cellule immunosoppressive (cioè, MDSC, cellule T regolatorie, ecc.) possa attenuare le risposte immunitarie effettrici ed abrogare ef.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JMN riconosce sostegno finanziario dal National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) e dal National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) entrambi i National Institutes of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Questo progetto è stato supportato anche dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e l'assistenza di esperti di Joel M. Sederstrom.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 12 settimaneJackson Laboratory N/ATopi utilizzati nei nostri studi sui tumori
Linea cellulare di cancro singenico murino MEERAcquisita dal collaboratore N/AE6/E7 Linea cellulare di carcinoma epiteliale tonsillare murino che esprime l'antigene HPV 
Alcool isopropilico al 70% EMD Milipore PX1840
Kit di strumenti chirurgici muriniPrecision InstrumentsMOUSEKITPrincipalmente ha bisogno solo di forbici, pinzette e bisturi.
Piastra a 24 pozzetti Denville Scientific Inc.T1024O qualsiasi piastra a fondo piatto a 24 pozzetti.
RPMI-1640 mediaSigma-AldrichR0883
Collagenasi I EMD Milipore234153
Collagenasi IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNasi I Sigma-Aldrich11284932001
agitatore orbitale a bassa velocitàBioExpress (fornitore: Genemate) S-3200-LSO qualsiasi agitatore orbitale.
Incubatore termoregolatoreFisher Scientific13-255-27O qualsiasi altro incubatore termoregolato
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 mL Pipetta e puntaliEppendorf13-690-032O qualsiasi altra pipetta e puntali
40 um Filtri cellulariFisher Scientific22363547
Provette da centrifuga da 50 mlDenville Scientific Inc.C1062-P
Provette coniche da 15 mLDenville Scientific Inc.C1012
Siringa Luer-Lok da 10 mL senza aghiBD309604
Lymphoprep Densità Gradiente MedioSTEMCELL Technologies7811
Pipette di trasferimentoDenville Scientific Inc.P7212
Piastre con fondo a U a 96 pozzetti,Denville Scientific, Inc.
DPBSSigma Aldrich D8573
Set di tamponi di colorazione del fattore di trascrizione FoxP3ThermoFisher Scientific00-5523-00Tampone di Fissazione/Permeabilizzazione e Tampone di Permeabilizzazione
CentrifugaTermoregolata Eppendorf Citometro a flusso 5810 R
Attune NxTThermoFisher ScientificN/APer il conteggio volumetrico di cellule a 96 pozzetti 
Ratto purificato anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)  Clone 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte blu fissabile, per eccitazione UVThermoFisher ScientificL34962colorazione di vitalità fissabile
(30-F11), APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
TCR beta anticorpo monoclonale (H57-597), APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8-&alfa; Anticorpo (KT15), PESanta Cruz Biotechnologysc-53473 
Anticorpo monoclonale CD4 (GK1.5), PE-Cianina5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC Classe II (I-A/I-E) Anticorpo monoclonale (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
Anticorpo monoclonale CD11c (N418), PE-Cianina5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80 Anticorpo monoclonale (BM8), eFluor 450Anticorpo48-4801-80
CD11b (M1/70), APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) anticorpo monoclonale (RB6-8C5), PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) anticorpo monoclonale (MIH5), PE-cianina 7ThermoFisher Scientific25-5982-80
Anticorpo monoclonale CD273 (B7-DC) (122), Anticorpo monoclonale PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67 (B56), BV711BD Biosciences563755
World Anticorpo monoclonale CD45 con monoclonale ThermoFisher Scientific

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor Immune MicroenvironmentFlow Cytometry AnalysisTumor Enzymatic DigestionDensity Gradient SeparationImmune Cell EnrichmentSubcutaneous Murine TumorsTumor Infiltrating LeukocytesCD45 Positive CellsCell Viability AssessmentImmunophenotyping Panel

Related Articles