Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada
Summary
Aquí describimos un procedimiento para probar la migración la célula en vitro con un microscopio de cámara óptica automatizada. El ensayo de rayado ha sido ampliamente utilizado donde el cierre de la raya es seguido por un período determinado. El microscopio óptico permite la detección confiable y barata de migración de la célula.
Abstract
Migración celular es un proceso importante que influye en muchos aspectos de la salud, como la cicatrización de heridas y el cáncer, y por lo tanto, es crucial para el desarrollo de métodos para el estudio de la migración. El ensayo de rayado ha sido el método más común de en vitro para probar compuestos con propiedades anti y pro migration debido a su bajo costo y simple procedimiento. Sin embargo, un problema a menudo informado del ensayo es la acumulación de células en el borde de la raya. Además, para obtener datos de lo análisis, imágenes de diferente exposición deben tomarse durante un período de tiempo en el mismo lugar exacto para comparar los movimientos de la migración. Programas de análisis diferentes pueden utilizarse para describir el cierre scratch, pero son intensivas en mano de obra, inexacto y las fuerzas de los ciclos de cambios de temperatura. En este estudio, demostramos un método optimizado para probar el efecto de la migración, por ejemplo con las proteínas que ocurren naturalmente humanos y bovinos lactoferrina y su péptido N-terminal Lactoferricin en la línea de células epiteliales HaCaT. Una optimización crucial es lavar y rayar en PBS, que elimina la mencionada acumulación de células en el borde. Esto podría explicarse por la eliminación de cationes, que han demostrado tener un efecto en la conexión de la célula de queratinocitos. Para asegurar la detección real de la migración, previo tratamiento con mitomicina C, un inhibidor de la síntesis de ADN, fue agregado al Protocolo. Finalmente, demostramos la automatizado óptica cámara, que elimina los ciclos de temperatura excesiva, mano de obra con el análisis de cierre scratch, mejora en la reproducibilidad y garantizando el análisis de secciones idénticas de cero con el tiempo.
Introduction
La migración es un proceso importante que influye en varios aspectos fisiológicos. En la cicatrización de heridas, migración facilita la re-epitelización de la piel. En las heridas no cicatrizan, como heridas crónicas, bacterias oportunistas causan infección de la herida, y las heridas abiertas son ideales para el crecimiento de bacterias y formación de biofilm1,2. Biofilm es una de las causas del desarrollo de bacterias resistentes, que es una de las mayores amenazas a nuestra sociedad moderna3. En la curación de la herida, las células inmunitarias no pueden penetrar el biofilm. En el cáncer, la migración de las células cancerosas es un paso fundamental de la metástasis, que es la principal causa de muerte para los pacientes con tumores sólidos4,5. Por lo tanto, es crucial poder estudiar la migración.
El ensayo de rayado se utiliza a menudo para probar la migración de la célula porque es barato y fácil de realizar en líneas de células adherentes, tales como fibroblastos endoteliales y células epiteliales líneas6,7. Hoy en día, existen varios métodos para realizar rayas8y diversos materiales se han divulgado para ser utilizado, incluyendo palillos9, celular raspadores10, láseres11y corrientes eléctricas12. Todos los métodos tienen desventajas y ventajas diferentes, y el método debe ser decidido según la herramienta de análisis, presupuesto y tipo de célula. Por ejemplo, si el tipo de celda utilizado requiere revestimiento, retiro de presión manual, por ejemplo con una punta de palillo de dientes o de la pipeta, influirá en la migración dentro de la zona, se debe usar un método diferente. En este estudio, nos centraremos en raspado manual.
Una desventaja para el raspado manual es la variación del tamaño, las formas de los arañazos y acumulación de células en los bordes del scratch. Existen muchos protocolos, y un papel altamente citado informa aumento de la velocidad o lavar bien después de rayar13. Además, se han utilizado varios métodos para reducir al mínimo la proliferación, ya que la proliferación de las células no se puede diferenciar de la migración y por lo tanto puede dar resultados falsos positivos de la migración. Algunos divulgan métodos son hambre suero precede el rasguño14 y disminuyendo la cantidad de suero15. Sin embargo, ninguno de estos métodos puede asegurar que no hay ninguna proliferación. Por lo tanto, se presenta un tratamiento previo de las células con el mitomycin C para obtener resultados verdaderos de la migración. La mitomicina C es un antibiótico que inhibe la síntesis de ADN mediante la formación de un enlace covalente con el ADN, lo que impide que el ADN separa16. Por el tratamiento con mitomicina C y lavar con PBS antes de rayar, el cierre detectado de la brecha muestra la verdadera migración de las células (figura 1).
Una característica de todos los métodos es la necesidad de un sistema para analizar el proceso de migración17. Común y un método económico para analizar el progreso es usar un microscopio de campo de luz para tomar imágenes de la cero en momentos predeterminados, seguidos de un análisis del cierre de la brecha en un software de imagen18,19. Este método es lento, poco fiable en cuanto a tomar fotografías en el mismo lugar y el enfoque, y el movimiento de la incubadora a cámara las fuerzas ciclos de cambios de temperatura mientras se toman fotos. Otros métodos se han desarrollado para detectar la migración midiendo el flujo de corriente. Los cambios actuales, como las células cubren más espacio en la placa, que se lee como un aumento en la impedancia20. Mediante la medición de impedancia, no se ve afectado el medio ambiente de las células, y por lo tanto se considera el método no invasivo. Este método se basa en platos especializados con electrodos de oro, que son caros, pero permiten la detección de muchos procesos, como la adhesión celular, proliferación, migración y muerte celular. Una gran desventaja de este método es que la medición de impedancia no indica directamente la migración, como factores como la temperatura tienen un gran impacto en la impedancia. Cambios en la impedancia pueden ser causadas por varios factores que no son revisados por el software, haciendo más difícil el análisis de los datos. Por lo tanto, la falta de visualización requiere un microscopio de luz convencional para verificar la migración.
Para superar muchos de los inconvenientes de las técnicas disponibles, utilizamos una cámara óptica automatizada en tiempo real. La cámara óptica es un sistema de detección con un microscopio de alto rendimiento en una plataforma pequeña con una lente, unidad de iluminación y una cámara digital. Cuenta con un software incorporado, que puede probar la migración y proliferación entre otras cosas. Para detectar la migración, se utilizan dos algoritmos para analizar el crecimiento y la cinética de la migración de las células, que se llaman la proliferación y la cicatrización análisis, respectivamente. El análisis de la proliferación se basa en un algoritmo de segmentación de imagen de dos etapas que se aplica el análisis de textura para detectar la diferencia entre zonas cubiertas de la célula (se muestra en amarillo) y vacío fondo áreas por análisis del histograma avanzado. La cicatrización de análisis se basa en un algoritmo de tres pasos que detecta la monocapa celular, localiza el boquete de la herida y determina el ancho de la brecha. Estos pasos se llevan a cabo en momentos determinados por el usuario y los datos se presentan como área cubierta, distancia y área de boquete. Una de las grandes ventajas de esta máquina es que permite la proyección de imagen de células adherentes a través de líquido debido al ángulo de la cámara21. Las imágenes de lenstakes inclinado de cámara que se proyectan a una pila de z de un solo plano z generan para asegurarse de que las fotos son foco (figura 2). pilas de z se generan por la fusión de la serie de fotografías (por ejemplo 40) perpendiculares al borde de la herida y a través de la herida toda. Las pilas de z permite la captación de la profundidad de la capa de células, así como un plano de foco a través de la herida. Además, la serie de imágenes se puede poner junto a una colección de vídeos de las imágenes con el clic de un botón.
Demostramos un protocolo optimizado para la detección de la migración en la línea celular de queratinocitos HaCaT. Hemos probado lactoferrina y su péptido N-terminal, Lactoferricin, de seres humanos y las vacas, para analizar su efecto sobre la migración como estas moléculas se han demostrado tener numerosas aplicaciones como antimicrobiano e inmune modulación de moléculas22 , 23. los cuatro compuestos se compararon con las células HaCaT no tratadas y factor de crecimiento epidérmico (EGF) fue utilizado como control positivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La importancia de la migración en los estudios del desarrollo, la cicatrización de heridas, Inmunología y cáncer ha llevado a varios métodos para estudiar la migración. La migración puede ser una expresión de la expansión o el cierre de la brecha por las células. Se prueba más a menudo posible cierre del cero, que es más fácil crecer las células en una monocapa y luego hacer un rasguño que el crecimiento de las células en forma específica8. Nuestro estudio demuestra un método opt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Consejo Danés de investigación independiente, tecnología y producción, otorgar #4005-00029
Materials
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
Riferimenti
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