En simpel og reproducerbar metode til at forberede membran prøver fra frisk isolerede rotte hjerne Microvessels
Summary
Her, er en metode til isolation af rotte hjernen microvessels og forberedelsen af membran prøver beskrevet. Denne protokol har den klare fordel at producere beriget microvessel prøver med acceptabel protein udbytte fra individuelle dyr. Prøver kan derefter bruges til robust protein analyser på hjernen mikrovaskulære endotelet.
Abstract
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk barriere væv, der reagerer på forskellige patofysiologiske og farmakologiske stimuli. Sådanne ændringer som følge af disse stimuli kan stærkt modulere medicinafgivelse til hjernen og dermed forårsage betydelige udfordringer i behandlingen af centralnervesystemet (CNS) sygdomme. Mange BBB ændringer, der påvirker Farmakoterapi, inddrage proteiner, der er lokaliseret og udtrykt på niveauet i endothelial celler. Faktisk, sådan viden på BBB fysiologi i sundhed og sygdom har udløst betydelig interesse for studiet af disse Membranproteiner. Fra et grundlæggende videnskab forskning synspunkt indebærer dette et krav om en simpel men robust og reproducerbar metode til isolation af microvessels fra hjernevæv høstet fra forsøgsdyr. For at forberede membran prøver fra frisk isoleret microvessels, er det nødvendigt at prøve præparater blive beriget i endothelial celler men begrænset i overværelse af andre celletyper neurovaskulære enhed (dvs., astrocytter, mikroglia, neuroner, pericytes). En ekstra fordel er evnen til at forberede prøverne fra enkelte dyr for at fange den sande variation af protein udtryk i en eksperimentel befolkning. I dette manuskript fremlægges oplysninger om en metode, der er udnyttet til isolation af rotte hjernen microvessels og forberedelse af membran prøver. Microvessel berigelse, fra prøverne stammer, er opnået ved hjælp af fire centrifugering trin hvor dextran er inkluderet i prøvebuffer. Denne protokol kan nemt tilpasses andre laboratorier for deres egne specifikke programmer. Prøver oprettes fra denne protokol har vist sig at give robust forsøgsdata fra protein analyse eksperimenter, der kan i høj grad støtte forståelsen af BBB svar til fysiologiske, patofysiologiske og farmakologiske stimuli.
Introduction
Blod – hjerne barrieren (BBB) findes på grænsefladen mellem det centrale nervesystem (CNS) og systemisk cirkulation og spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af hjernen homøostase. Specifikt, BBB funktioner til netop kontrol opløste koncentrationer i hjernen ekstracellulærvæsken og effektivt levere de næringsstoffer, der kræves af hjernevæv til at opfylde de store metaboliske krav af CNS1. Disse roller indebærer, at BBB, som findes primært på samme niveau som den mikrovaskulære endotel celle, skal have diskrete mekanismer, der aktiverer nogle stoffer til at få adgang til hjernen parenkym samtidig med at potentielt skadeligt fremmedstoffer ikke kan ophobes. Ja, hjernen mikrovaskulære endotelceller er ikke fenestrated og udviser begrænset pinocytosis, der sikrer en mangel på non-selektive permeabilitet2. Derudover express hjernen microvessel endotelceller tight junction og adherens krydset proteiner der fungerer til at danne en fysisk “seal” mellem tilstødende endotelceller og stærkt begrænse paracellular diffusion af blodbårne stoffer i hjernen parenkym. Faktisk, selektiv permeabilitet af endogene og eksogene stoffer kræver funktionelle udtryk for optagelse og efflux transportvirksomheder3. Samlede, stramme vejkryds, adherens vejkryds og transportvirksomheder arbejder i fællesskab for at opretholde de unikke barriereegenskaber af BBB.
BBB er en dynamisk barriere, der reagerer på fysiologiske, patofysiologiske og farmakologiske stimuli. For eksempel, har hypoxi/reoxygenation stress vist sig at modulere udtryk for kritiske tight junction proteiner (dvs., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), som er forbundet med øget paracellular permeabilitet til vaskulær markører sådanne som saccharose4,5,6. Lignende observationer er gjort på BBB i fastsættelsen af traumatisk hjerne skade7 og perifere inflammatorisk smerte8,9. Disse samme sygdomme kan også modulere transportmekanismer på BBB10,11,12,13,14. Faktisk, hypoxi/reoxygenation skade forbedrer funktionelle udtryk for økologisk anion transporterer polypeptid 1a4 (Oatp1a4) på BBB, hvilket kan føre til betydelige stigninger i blod til hjernen transport af specifikke Oatp transport substrater såsom taurocholate og atorvastatin13. BBB egenskaber kan også ændres ved Farmakoterapi, selv, en mekanisme, der kan danne grundlag for både dybtgående ændringer i medicin effektivitet i hjernen og stof-drug interaktioner. For eksempel, acetaminophen mål nukleare receptor signaling mekanismer i hjernen mikrovaskulære endotelceller, øger funktionelle udtryk for kritiske efflux transporter P-glykoprotein (P-gp), og ændrer tidsafhængig analgesi tillagt morfin, transport en opioide smertestillende stof og etablerede P-gp substrat15. En grundig forståelse af BBB ændringer, der kan være fremkaldt af sygdomme eller af stoffer, kræver også identifikation og karakterisering af bestemte reguleringsmekanismer, der styrer disse ændringer. Faktisk, diskrete signaling veje er blevet identificeret i hjernen mikrovaskulære endotelceller, der styrer den molekylære udtryk for tight junction proteiner16,17 og transportvirksomheder,15, 18,19. Taget sammen, indikerer disse observationer, at komplekse molekylære veje er involveret i reguleringen af BBB stramme kryds og transportvirksomheder i både sundhed og sygdom.
En betydelig udfordring i studiet af BBB er det absolutte krav om en enkel og effektiv metode til isolation af microvessels fra hjernevæv afledt af forsøgsdyr og efterfølgende udarbejdelse af membran prøver. Disse prøver skal være forberedt, så de er både beriget i hjernen mikrovaskulære endotelceller og begrænset i tilstedeværelse af andre celletyper. Over de sidste mange år, har flere metoder til isolering af microvasculature fra gnaver hjerne blevet rapporteret i den videnskabelige litteratur13,20,21,22. Denne artikel beskriver en enkel, robust, og reproducerbar metode til dyrkning af microvessels fra rotte hjernen og forberedelse i endothelial membran-beriget prøver, der kan bruges til analyse af protein udtryk. En fordel ved denne microvessel isolation protokol er evnen til at opnå prøve præparater af høj kvalitet og med tilstrækkelig protein udbytte fra individuelle eksperimentelle dyr. Dette giver mulighed for hensyntagen til indbyrdes animalske variabilitet i protein udtryk. Sådan et forskud i denne protokol har væsentligt forbedret robustheden af BBB undersøgelser, fordi overvurdering (eller lav ansættelse) af den sande dumpingmargenens protein ændringer på BBB kan nu undgås. Derudover muliggør optagelse af flere centrifugering trin med dextran forbedret berigelse af microvessels i eksperimentelle prøver samtidig letter fjernelse af uønskede cellebestanddele som neuroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel beskrives en simpel og effektiv metode til membran protein prøver fra microvessels frisk isoleret fra rotte hjernevæv. Flere metoder til isolering af rotte hjernen microvessels og/eller generations membranen præparater fra isolerede microvasculature er blevet rapporteret i litteraturen13,20,21,22 , 24. selv om den microvessel isolation proto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01-NS084941) og Arizona biomedicinsk forskning Kommissionen (ADHS16-162406) til PTR. WA har modtaget tidligere støtte fra en PhD udnævnelse til nationale institutter for sundhed uddannelse tilskud (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
Riferimenti
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
