السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية
Summary
وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الدماغ المورفولوجية . باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تطبيق المركبات الطبيعية أو الاصطناعية إلى المخزن المؤقت لاختبار قدرتها على تنشيط معينة من الخلايا العصبية في الدماغ.
Abstract
الجهاز على الجهاز الاتصال بالإشارات الغدد الصماء، على سبيل المثال، من العالم الخارجي إلى الدماغ، ضروري للحفاظ على التوازن. كحيوان نموذج لأبحاث الغدد الصماء، يتزايد استخدام melanogaster المورفولوجية، الذي قد متطورة أدوات الجينية ومعلومات الجينوم،. توضح هذه المقالة طريقة لتصوير الكالسيوم explants الدماغ المورفولوجية . هذا الأسلوب يتيح الكشف عن الإشارات المباشرة هرمون في الدماغ. فمن المعروف جيدا أن العديد من الببتيد الهرمونات تعمل عن طريق مستقبلات إلى جانب البروتين G (جبكرس)، التنشيط الذي يؤدي إلى زيادة تركيز Ca2 +داخل الخلايا. كما يرفع التنشيط العصبية داخل الخلايا Ca2 + مستويات، من Ca2 + تدفق وإصدار Ca2 + مخزنة في هيولى (ER). جهاز استشعار كالسيوم، جكامب، ويمكن رصد هذه Ca2 + التغييرات. في هذا الأسلوب، يتم التعبير عن جكامب في الخلايا العصبية للفائدة، وتشريح الدماغ اليرقات الإعراب عن جكامب ومثقف السابقين فيفو. ثم يتم تطبيق اختبار الببتيد ل explant الدماغ، وتم الكشف عن التغييرات الفلورسنت في جكامب استخدام مجهر [كنفوكل] قرص غزل مزودة بكاميرا CCD. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن أن يكون اختبار أي جزيء للذوبان في الماء، ومختلف الأحداث الخلوية المرتبطة بالتنشيط العصبية يمكن تصويرها باستخدام المؤشرات المناسبة الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، عن طريق تعديل قاعة التصوير، يمكن استخدام هذا الأسلوب الصورة المورفولوجية الأجهزة الأخرى أو أجهزة الحيوانات الأخرى.
Introduction
الاتصالات الجهاز للجهاز استراتيجية تقحم مصانة للحفاظ على التوازن التأقلم مع التغيرات البيئية. في البشر، ومجموعة متنوعة من أريريلياسيد الهرمونات من الغدد الصماء إلى الدورة الدموية. العديد من هذه الهرمونات المستهدفة تحت المهاد الدماغ، والذي ينظم عمليات الأيض والسلوكيات الأساسية مثل التغذية1،2. تم اكتشاف العديد من الهرمونات باستخدام نماذج الثدييات. ومع ذلك، آليات عملها، لا سيما شبكات إينتيرورجان التي تشارك فيها، لا تزال غير واضحة إلى حد كبير.
وبرز melanogaster المورفولوجية نموذجا مفيداً لدراسة الاتصالات الجهاز إلى الجهاز. في الحشرات، يتم التحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية بالهرمونات. أوائل الدراسات التي تركز على النمو والتحول تستخدم الحشرات الكبيرة. في هذه الدراسات، لإزالة أو زرع الأعضاء محددة وتوقع وجود جزيئات إشارات الجهاز بين الوكالات؛ في وقت لاحق، كانت الأحداث هرمون (جون) وهرمون بروثوراسيكوتروبيك (بتث) و Ecdysone المتحلل المنقي3،،من45. ويعتقد عائلة كبيرة من الببتيدات إرسال الإشارات بين الخلايا للمشاركة في مختلف الأحداث الفسيولوجية أثناء دورة حياة الحشرات6،7. معظم هذه الببتيدات قانون إلى جانب البروتين ز مستقبلات (جبكرس)، على الرغم من أن جبكرس محددة كانت صعبة في البداية لتحديد استخدام النهج التقليدية. وكان المنشور المورفولوجية لتسلسل الجينوم كله8 الانطلاقة التي مكنت من تحديد هوية الببتيدات النشطة بيولوجيا المورفولوجية استناداً على التماثل لتلك الموجودة في غيرها من الحشرات. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد المستقبلات لعدة الببتيدات من جبكرس وتوقع في الجينوم باستخدام فحوصات ملزمة GPCR-يجند خلية-المستندة إلى الثقافة. المقبل، وتعبير تحاليل توقع مسارات الجهاز إلى الجهاز وأثارت هذه الببتيدات والمستقبلات. جدير بالذكر أن العديد من مستقبلات الببتيد المفترضة مبينة في الدماغ، مما يدل على أن الدماغ هدفا رئيسيا ل الهرمونات الببتيد9. وعلاوة على ذلك، أسهمت الأدوات الوراثية المتقدمة في المورفولوجية لتحديد الأدوار الفيزيولوجية لتركيبات GPCR الببتيد. على سبيل المثال، GAL4، ونظم النسخي ثنائي المستندة إلى ليزا تمكين الجينات ضربة قاضية أو overexpression بطريقة منضبطة مكانياً وزمنياً. GAL4، عامل نسخ المحددة في الخميرة، ربط تسلسل رابطة الدول المستقلة-تنظيمية محددة تسمى التسلسل التنشيط المنبع (UAS). في النظام GAL4/UAS، يوفر سطر برنامج التشغيل الخاصة بالانسجة أو الخاصة بمرحلة GAL4 التعبير والخط المستجيب يحمل UAS المنبع من الجينات من الفائدة أو البناء على محرك الأقراص شرنا التعبير. ويستند نظام ليزا/ليكساوب إليه مماثلة. تحليلات المظهرية الخاصة بالانسجة الببتيد-ضربة قاضية والأنسجة على حدة ضربة قاضية GPCR الحيوانات يمكن أن تكشف عن معلومات حول وضع إشارات GPCR الببتيد وموقع العمل. ومع ذلك، تقتصر الاستنتاجات التي يمكن الوصول إليها فقط عن طريق البيانات الوراثية. من ناحية أخرى، مرة واحدة هو تضييق نطاق الهدف المفترضة لهرمون الببتيد خاصة لنوع النسيج أو الخلية، يمكن استخدام السابقين فيفو الكالسيوم التصوير في اكسبلانتس الجهاز لتوضيح الاتصالات الجهاز إلى الجهاز بإشارة هضميد-GPCR وساطة. عند التنشيط هذه العملية إلى جانب Gq، هو زيادة Ca2 + تركيز داخل الخلايا نتيجة إطلاق Ca2 + من أية10. في الدماغ، ويرفع التنشيط العصبية أيضا Ca2 + مستويات داخل الخلايا. ويمكن الكشف عن هذه Ca2 + الزيادات بجهاز استشعار كالسيوم، جكامب، الذي يخضع لتغيرات conformational حضور Ca2 + الناتج في الأسفار الانبعاثات11.
في هذه المقالة، يتم وصف كالسيوم طريقة التصوير باستخدام الدماغ المورفولوجية explants. لاختبار قدرة الببتيد لتنشيط الخلايا العصبية المحددة، يتم تطبيق ببتيد اختبار explant الدماغ معربا عن جكامب، والأسفار التغييرات تتم مراقبتها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل]. وتؤكد مشاركة هذه العملية ثم إجراء المقايسة نفس دماغ المسخ التي تفتقر إلى هذه العملية استخدام. هذا المزيج من التصوير وعلم الوراثة يوفر معلومات دقيقة عن الجهاز لجهاز الاتصالات من الببتيدات-جبكرس-إمكانية إجراء تعديلات وتطبيقات لهذا البروتوكول وتناقش أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 + التصوير الأسلوب الموصوفة هنا نظام مفيد لاختبار وظيفة الهرمونات في الدماغ. ويتلقى المجراة، الدماغ الهرمونات من مختلف أجهزة الغدد الصماء. وبالإضافة إلى ذلك، يدرك الدماغ باستمرار تصاعدي المعلومات الحسية، مما يسبب تنشيط الخلايا العصبية التلقائية. هذا النظام السابقين فيفو </…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل تدعمها معونة للبحث العلمي (15 ك 07147، 17 ك 07419) من JSPS (إلى هيروشي ايشيموتو، سانو هيروكو)، اينامورى مؤسسة البحوث منحة (مرحبا)، وبرنامج مركز أبحاث/الاستخدام المشترك “الطب التنموي”، في معهد علم الأجنة الجزيئية وعلم الوراثة، جامعة كوماموتو (للنظام المنسق). ونحن نشكر الدكتور أزوسا كاميكوتشى والسيد يامادا دايتشي لمساعدتهم في استخدام نظام التصوير.
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
Riferimenti
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
- Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
