Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila
Summary
Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.
Abstract
Órgão-órgão-a comunicação por sinalização endócrina, por exemplo, da periferia para o cérebro, é essencial para manter a homeostase. Como um animal de modelo para a investigação do sistema endócrino, Drosophila melanogaster, que tem sofisticadas ferramentas genéticas e informação do genoma, está sendo usado cada vez mais. Este artigo descreve um método para o tratamento de imagens de cálcio de explantes de cérebro de Drosophila . Esse método permite a detecção da sinalização direta de um hormônio no cérebro. É sabido que muitos Hormônios peptídicos agem através de receptores G-proteína-acoplados (GPCRs), cuja ativação causa um aumento na concentração Ca2 +intracelular. Ativação neural também eleva intracelular Ca2 + níveis, do influxo de Ca2 + e a liberação de Ca2 + armazenados no retículo endoplasmático (ER). Um sensor de cálcio, GCaMP, pode monitorar essas mudanças de Ca2 + . Neste método, o GCaMP é expresso nos neurônios de interesse, e o cérebro larval GCaMP-expressando é dissecado e culta ex vivo. O teste de peptídeo é então aplicado ao explante cérebro, e as alterações fluorescentes em GCaMP são detectadas usando um microscópio confocal de fiação disco equipado com uma câmera CCD. Usando este método, qualquer molécula solúvel em água pode ser testada, e diversos eventos celulares associados a ativação neural podem ser fotografados usando os indicadores fluorescentes apropriados. Além disso, modificando a imagem da câmara, este método pode ser usado para a imagem de outros órgãos de drosófila ou os órgãos de outros animais.
Introduction
Órgão-órgão-a comunicação é uma estratégia evolutivamente conservada para manter a homeostase para lidar com as mudanças ambientais. Em humanos, uma variedade de arereleased de hormônios das glândulas endócrinas na circulação. Muitos desses hormônios como alvo o hipotálamo do cérebro, que regula os processos metabólicos e comportamentos fundamentais tais como alimentação1,2. Muitos hormônios foram descobertos usando modelos de mamíferos. No entanto, os mecanismos de sua ação, especialmente as redes interorgan, em que participem, permanecem em grande parte obscuro.
Drosophila melanogaster emergiu como um modelo útil para estudar órgão-para-órgão comunicação. Em insetos, muitos processos fisiológicos são controlados pelos hormônios. Primeiros estudos centrada no crescimento e metamorfose usado grandes insetos. Nesses estudos, a remoção ou transplante de órgãos específicos previu a existência de moléculas sinalizadoras órgãos inter; mais tarde, hormônio juvenil (JH), hormônio Prothoracicotropic (PTTH) e isoinokosterone foram bioquimicamente purificada3,4,5. Uma grande família de peptídeos de sinalização intercelulares é pensada para ser envolvido em vários eventos fisiológicos durante o ciclo de vida de inseto6,7. A maioria destes peptídeos atuam sobre G-receptores (GPCRs), embora os GPCRs específicos foram inicialmente difícil identificar abordagens convencionais. A publicação do genoma de Drosophila sequência8 foi a descoberta que permitiu a identificação de peptídeos bioativos de Drosophila baseada sua homologia aos encontrados em outros insetos. Além disso, identificaram-se os receptores para vários péptidos de GPCRs previstos no genoma usando ensaios de ligação GPCR-ligante cell-cultura-based. Em seguida, as análises de expressão previram os caminhos de órgão-para-órgão eliciados estes peptídeos e receptores. Notavelmente, muitos dos receptores de peptídeos putativos são expressos no cérebro, sugerindo que o cérebro é um alvo principal do peptídeo hormônios9. Além disso, as ferramentas avançadas de genéticas em Drosophila têm contribuído para a identificação de funções fisiológicas das combinações de peptídeo-GPCR. Por exemplo, a GAL4 e LexA-baseado sistemas binários transcriptional permitem knockdown do gene ou superexpressão de forma controlada espacial e temporalmente. GAL4, um fator de transcrição identificado no fermento, vincula-se a uma sequência de cis-regulamentação específica denominada sequência de ativação Upstream (UAS). No sistema GAL4/UAS, linha excitador fornece tecido-específica ou expressão de GAL4 estágio específico e a linha de respondente carrega UAS montante do gene de interesse ou a construção, a expressão de shRNA de unidade. LexA/LexAop sistema é baseado em um mecanismo semelhante. Análise fenotípica de animais de GPCR-nocaute de peptídeo-knockdown e tecido-específica de tecido-específica pode revelar informações sobre modo do peptídeo-GPCR sinalização e local de ação. No entanto, as conclusões que podem ser alcançadas apenas por dados genéticos são limitadas. Por outro lado, uma vez que o alvo putativo de um hormônio peptídeo específico é reduzido a um tipo de tecido ou célula, cálcio ex vivo de imagem em explantes de órgão pode ser usado para elucidar a órgão-para-órgão comunicação mediada por sinalização de peptídeo-GPCR. Após a ativação de um GPCR Gq-acoplado, a concentração intracelular de Ca2 + é aumentada devido à liberação de Ca2 + do ER10. No cérebro, ativação neural também eleva os níveis intracelulares de Ca2 + . Tais aumentos de Ca2 + podem ser detectados por um sensor de cálcio, GCaMP, que sofre mudanças conformacionais na presença de Ca2 + resultando em emissão de fluorescência11.
Neste artigo, é descrito um método de imagem usando o cérebro de Drosophila explants de cálcio. Para testar a capacidade de um peptídeo para ativar os neurônios específicos, um peptídeo de teste é aplicado para o explante cérebro GCaMP-expressando, e mudanças de fluorescência são monitoradas pela microscopia confocal. O envolvimento do GPCR é então confirmado, realizando o mesmo ensaio usando um cérebro mutante falta GPCR. Esta combinação de genética e de imagem fornece informações precisas sobre o órgão-para-órgão de comunicação por peptídeos-GPCRs. possíveis modificações e aplicações do presente protocolo são também discutidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O Ca2 + imagem método descrito aqui é um sistema útil para testar o funcionamento dos hormônios no cérebro. In vivo, o cérebro recebe hormônios de vários órgãos do sistema endócrino. Além disso, o cérebro constantemente vê crescente de informações sensoriais, que provoca a ativação neuronal espontânea. Este sistema ex vivo elimina tal ruído e produz uma relação sinal/ruído melhor do que na vivo de imagem. Neste sistema, as moléculas podem ser testadas isoladam…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Grants-in-Aid para pesquisa científica (15K 07147, 17K 07419) de JSPS (para Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), uma bolsa de investigação Inamori Foundation (para HI) e o programa de centro de uso/pesquisa conjunta para medicina do desenvolvimento, em o Instituto de embriologia Molecular e genética, Universidade de Kumamoto (para HS). Agradecemos o Dr. Azusa Kamikouchi e Sr. Daichi Yamada por sua ajuda na utilização do sistema de imagem.
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
Riferimenti
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