नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस Germline का अभिकलनी विश्लेषण
Summary
हम Caenorhabditis एलिगेंस germline के तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए एक स्वचालित विधि प्रस्तुत करतेहैं । हमारे विधि germline और विश्लेषण germline प्रोटीन वितरण और cytoskeletal संरचना के भीतर प्रत्येक नाभिक की संख्या और स्थिति निर्धारित करता है ।
Abstract
Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) germline स्टेम सेल विकास, apoptosis, और गुणसूत्र गतिशीलता सहित कई जैविक रूप से महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । जबकि germline एक उत्कृष्ट मॉडल है, विश्लेषण अक्सर दो समय और तीन आयामी विश्लेषण के लिए आवश्यक परिश्रम के कारण आयामी है । ऐसे अध्ययनों में प्रमुख readouts germline के भीतर नाभिक और प्रोटीन वितरण की संख्या/ यहां, हम germline के प्रत्येक क्षेत्र में संख्या और नाभिक की स्थिति निर्धारित करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी और गणनात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर germline के स्वचालित विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । हमारे विधि भी germline प्रोटीन वितरण कि विभिंन आनुवंशिक पृष्ठभूमि में प्रोटीन अभिव्यक्ति के तीन आयामी परीक्षा में सक्षम बनाता है विश्लेषण करती है । इसके अलावा, हमारे अध्ययन germline है कि विशिष्ट स्थानिक विकास आवश्यकताओं को समायोजित कर सकते है के विभिंन क्षेत्रों में cytoskeletal वास्तुकला में बदलाव से पता चलता है । अंत में, हमारे विधि प्रत्येक germline के spermatheca में शुक्राणु की स्वचालित गिनती सक्षम बनाता है । एक साथ लिया, हमारी विधि में सक्षम बनाता है तेजी से और reproducible के phenotypic विश्लेषण C. एलिगेंस germline ।
Introduction
स्तनधारियों के साथ संकेत रास्ते के संरक्षण सी. एलिगेंस एक उत्कृष्ट करने के लिए एकाधिक जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन1,2मॉडल बनाता है । हमारी प्रयोगशाला में, हम स्टेम सेल विकास, apoptosis, और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए C. एलिगेंस germline का उपयोग करते हैं । जबकि germline एक तीन आयामी संरचना है, कई अध्ययनों से दो समय लेने वाली और श्रम तीन आयामी विश्लेषण के गहन प्रकृति के कारण आयामी हैं । यह बहुत संभावना है कि दो आयामी विश्लेषण germline में vivo घटनाओं में misrepresent हो सकता है । C. एलिगेंस वयस्क द्विलिंग दो germline हथियार है, जिनमें से प्रत्येक एक दैहिक बाहर टिप सेल (डीटीसी) है कि एक विभेदित राज्य3,4में बाहर रोगाणु कोशिकाओं का कहना है कि घरों । इन रोगाणु कोशिकाओं के रूप में वे डीटीसी से दूर ले जाने के अंतर शुरू, इसके प्रभाव से बचने, और अंडाणुओं और शुक्राणु बन के रूप में वे germline के समीपस्थ अंत तक पहुँचने । इस प्रक्रिया के दौरान, रोगाणु कोशिका नाभिक, अर्धसूत्रीविभाजन5,6के लिए संक्रमण से पहले बँटवारा से गुजरना । शुक्राणु उत्पादन लार्वा चरण 4 (L4) के विकास के द्वारा पूरा हो गया है, जिसके बाद अंडाणुओं वयस्कता के दौरान उत्पादित कर रहे हैं । शुक्राणु spermatheca में संग्रहित होते हैं जहां वे भ्रूण उत्पन्न करने के लिए अंडाणुओं की खाद बनाते हैं ।
वहां कई आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि नाभिक की संख्या में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप सी एलिगेंस में germline विकास को प्रभावित कर सकते हैं, अपोप्तोटिक घटनाओं की संख्या, गुणसूत्र गतिशीलता, और प्रोटीन अभिव्यक्ति और/ ,8,9,10,11. इन घटनाओं के विश्लेषण परमाणु आकृति विज्ञान और वितरण के आधार पर भेदभाव के प्रत्येक चरण की पहचान की आवश्यकता है । सही ढंग से इन मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए एक बड़े नमूना आकार के साथ श्रम-प्रधान और समय लेने वाली है । इन कमियों को दरकिनार करने और विश्लेषण की निरंतरता को सक्षम करने के लिए, हमने नाभिक काउंटिंग, नाभिक वितरण, प्रोटीन एक्सप्रेशन, और cytoskeletal के लिए C. एलिगेंस germline की तीन आयामी परीक्षा के लिए एक स्वचालित विधि विकसित की संरचना. तीन आयामी प्रतिपादन के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन से, हम रोगाणु कोशिका विभेद के प्रत्येक चरण की पहचान के लिए आकार और आकार मापदंडों उत्पन्न । इसके अलावा, इस विधि रोगाणु कोशिका नाभिक और शुक्राणु प्लस प्रत्येक oocyte में गुणसूत्र संख्या के स्कोरिंग की गिनती में सक्षम बनाता है ।
germline में एक महत्वपूर्ण संरचना cytoskeleton है, जो germline डिब्बे को स्थिरता प्रदान करता है, एड्स cytoplasmic स्ट्रीमिंग और germline नाभिक12को संरक्षण । गणना प्रतिपादन का उपयोग करना, हम germline cytoskeleton के तीन आयामी पुनर्निर्माण प्रदर्शन किया और germline के भीतर विशिष्ट cytoskeletal सुविधाओं की पहचान की. यहां, हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल वर्णन करने के लिए कैसे गणना फोकल इमेजिंग के साथ संयुक्त विश्लेषण की व्याख्या सी. एलिगेंस germline के व्यापक विश्लेषण में सक्षम बनाता है ।
हम C. एलिगेंस germline (चित्रा 1) के तीन आयामी विश्लेषण के लिए एक तीव्र विधि का प्रस्ताव है । तीन आयामी विश्लेषण का उपयोग करना, यह germline नाभिक के तीन आयामी वितरण का अध्ययन करने के लिए संभव है (चित्रा 2 और चित्रा 3), कोशिकाओं की स्वचालित गिनती (चित्रा 2), germline cytoskeleton के पुनर्निर्माण ( चित्रा 3), प्रोटीन का वितरण (चित्रा 4), और अंडाणुओं में spermatheca और गुणसूत्रों में शुक्राणु की संख्या स्कोरिंग (चित्रा 5). विधि न केवल germline के आसान और सटीक ठहराव सक्षम बनाता है, लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक phenotypes की पहचान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सटीकता में सुधार और germline विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए है । विच्छेदित germlines की मानक तैयारी के बाद, germline नाभिक का एक तीन आयामी मॉडल गणनात्मक प्रतिपादन द्वारा तैयार किया ज?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके तकनीकी समर्थन के लिए मोनाश Microimaging धंयवाद । कुछ उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र है, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई । इस काम के लिए एक मोनाश विश्वविद्यालय के द्वारा समर्थित किया गया था एक चिकित्सा डिस्कवरी फैलोशिप, NHMRC परियोजना अनुदान (GNT1105374), NHMRC वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप (GNT1137645) और veski इनोवेशन फैलोशिप: VIF 23 करने के लिए रोजर Pocock.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
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