Gør konjugation-induceret fluorescerende pegyleret viruslignende partikler af Dibromomaleimide-disulfid kemi
Summary
Vi præsenterer her, en procedure for at fluorescently functionalize disulfider på Qβ VLP med dibromomaleimide. Vi beskriver Qβ udtryk og rensning, syntesen af dibromomaleimide-functionalized molekyler og konjugation reaktionen mellem dibromomaleimide og Qβ. Den resulterende gul fluorescerende konjugeret partikel kan bruges som et fluorescens sonde inde i cellerne.
Abstract
Den seneste stigning i viruslignende partikler (VLPs) i biomedicinsk og materialeforskning kan tilskrives deres lethed af biosyntesen, diskret størrelse, genetisk programmering og bionedbrydelighed. Mens de er meget modtagelig for bioconjugation reaktioner for at tilføje syntetiske ligander på deres overflade, er intervallet i bioconjugation metoder på disse vandig født capsids relativt begrænset. For at lette retning af funktionelle biomaterialer forskning, betragtes som ikke-traditionelle bioconjugation reaktioner. Den reaktion, der er beskrevet i denne protokol bruger dibromomaleimides til at indføre ny funktionalitet i opløsningsmidlet udsatte disulfid obligationer af en VLP baseret på Bacteriophage Qβ. Desuden, det endelige produkt er fluorescerende, som har den fordel at generere en sporbar in vitro- sonden ved hjælp af en kommercielt tilgængelig filtersæt.
Introduction
Ved hjælp af nano-størrelse viral capsids fremstod som et spændende felt, som har til formål at udvide anvendelsesområdet for applikationer i biomedicinsk forskning1,2,3. Recombinantly udtrykte viruslignende partikler (VLPs) er strukturelt afledt af virus, men de mangler den oprindelige viral genetiske materiale gør dem ikke-infektiøse proteinholdige nanopartikler. Som de overflade funktioner er genetisk programmerede og hver kapsid udtrykkes identisk til dem før og efter det, er det muligt at kende den placering og antallet af reaktive sidekæder af aminosyrer med atomistisk præcision. I mange tilfælde besidder både de udvendige og indvendige overflader mange slags opløsningsmiddel udsatte aminosyrerester, som realistisk kan være functionalized gennem bioconjugation reaktioner – reaktioner, der danner kovalente bindinger mellem et biomolekyle og syntetisk molekyle4,5.
Bioconjugation reaktioner hjælpe biomolekyler interesse har mere forskelligartede funktioner på en forholdsvis enkel måde. Molekyler af interesse, såsom terapeutiske lægemidler6, fluorescerende tags7 og polymerer8,9 kan pre syntetiseret og karakteriseret før de er fastgjort på overfladen af VLPs. En særlig fælles VLP i biomedicinske og biomaterialer forskning har været VLP baseret på Bacteriophage Qβ, der, som recombinantly udtryk, er en 28 nm ikosaedriske viral kapsid10. De mest almindelige reaktion websteder på Qβ er lysines med en bred margin, selvom vi har for nylig meddelt vellykket konjugation11 af dibromomaleimide forbindelser til de reducerede disulfider, denne linje porerne i Qβ via en Haddleton-Baker reaktion. Reaktionen forløber med godt udbytte, og lige så vigtigt, uden at miste den termiske stabilitet af partikler. På samme tid genererer denne reaktion konjugation-induceret fluorescens, som kan bruges til at spore optagelsen af disse partikler ind i celler. I dette arbejde vise vi konjugation af polyethylenglycol (PEG) på overfladen af Qβ gennem Haddleton-Baker reaktion, hvilket resulterer i en lys gul fluorophore. Disse partikler kan derefter spores, da de er taget af celler. Protokollen heri vil hjælpe forskerne med at generere nye fluorescerende pegyleret proteinholdige nanopartikler baseret på Qβ, selv om dens principper finder anvendelse for en af de mange andre VLPs, som indeholder opløsningsmiddel udsatte disulfider.
Protocol
Representative Results
Discussion
I forhold til mindre protein oprensning, er en unik trin i rensning af bacteriophage Qβ saccharose gradient centrifugering. Efter trinnet chloroform/n-butanol udvinding renses Qβ yderligere ved hjælp af 5-40% saccharose forløb. Under centrifugering adskilles partikler baseret på deres størrelser. Større partikler rejse til regionen højere tæthed, mens mindre partikler bo i regionen Nedre tæthed. Qβ rejser til den nederste tredjedel af gradient og forbliver der, mens mindre protein urenheder er fanget på toppe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. anerkender National Science foundation (DMR-1654405) og kræft forebyggelse Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) for deres støtte.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
Riferimenti
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochimica. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
