यह प्रोटोकॉल एक लागत प्रभावी दृष्टिकोण को अलग करने और माउस प्राथमिक गुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं है कि बाद में उप हो सकता है की विशेषताएं प्रदान करता है गुर्दे जैविक कार्यों mitochondrial जैव ऊर्जा सहित पूर्व vivo, का आकलन करें ।
गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (TECs) में Mitochondrial रोग गुर्दे फाइब्रोसिस, क्रोनिक गुर्दे की बीमारी (सीकेडी) का एक प्रमुख कारण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, प्राथमिक TECs में mitochondrial समारोह का आकलन कोशिकाओं की अधिक ऊर्जावान स्थिति में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान, सीकेडी के pathophysiology में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । जबकि विभिन्न प्रजातियों में अलगाव और समीपस्थ नलिकाओं के शोधन के लिए उपलब्ध जटिल प्रोटोकॉल के एक नंबर रहे हैं, क्षेत्र शुद्धि के लिए आवश्यकता के बिना ट्यूबलर कोशिका अलगाव के लिए अनुकूलित एक लागत प्रभावी विधि का अभाव है । यहाँ, हम दोनों प्राथमिक माउस समीपस्थ और बाहर की ओर गुर्दे TECs पर ध्यान केंद्रित कर अध्ययन के लिए अनुमति देता है कि एक अलगाव प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. लागत प्रभावी रिएजेंट और इस प्रोटोकॉल में आवश्यक ंयूनतम पशु प्रक्रियाओं के अलावा, अलग कोशिकाओं के अलगाव के बाद उच्च ऊर्जा का स्तर बनाए रखने और उप हो सकता है चार मार्ग तक संस्कृति, सतत अध्ययन के लिए अनुमति दी । इसके अलावा, एक उच्च प्रवाह extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर, हम mitochondrial श्वसन का आकलन सीधे अलग TECs में एक ९६ में अच्छी तरह से थाली जिसके लिए हम सेल घनत्व और यौगिक एकाग्रता के अनुकूलन के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल गुर्दे TECs के एक सुसंगत, अच्छी तरह से मानकीकृत उत्पादन के साथ गुर्दे ट्यूबलर पूर्व vivo अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल व्यापक भविष्य अनुप्रयोगों mitochondrial दवा खोज या दवा लक्षण वर्णन प्रयोजनों के लिए गुर्दे विकारों के साथ जुड़े रोग का अध्ययन हो सकता है ।
गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिका (टेक) समारोह दृढ़ता से गुर्दे की समग्र स्वास्थ्य हालत के साथ जुड़ा हुआ है. गुर्दे में रोग संकेतन TECs के भेदभाव का कारण बनता है, जो गुर्दे की फाइब्रोसिस और क्रोनिक गुर्दे की बीमारी (सीकेडी)1,2में एक प्रमुख भूमिका निभाता है । एक उच्च ऊर्जावान अंग के रूप में, गुर्दे ऑक्सीजन की खपत में केवल दिल के लिए दूसरा है, मुख्य रूप से mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण3के माध्यम से । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन गुर्दे नलिकाओं4में रोग की घटनाओं के लिए mitochondrial रूपात्मक परिवर्तन का एक सकारात्मक संबंध से पता चला है । TECs में Mitochondrial रोग गुर्दे फाइब्रोसिस उपकला के माध्यम से mesenchymal संक्रमण5 और दोषपूर्ण फैटी एसिड ऑक्सीकरण6का कारण बनता है । फाइब्रोसिस एक प्रगतिशील गुर्दे विकृति है कि सीकेडी में परिणाम है । इसलिए, गुर्दे TECs की ऊर्जावान स्थिति को समझने सीकेडी के pathophysiology को उजागर करने के लिए एक आवश्यकता है ।
वहां रहे है > 20 वयस्क गुर्दे में सेल प्रकार7। TECs के समारोह का अध्ययन करने के लिए, गुर्दे उपकला कोशिकाओं की एक प्राथमिक संस्कृति ऐसे रासायनिक उपचार और आनुवंशिक जोड़तोड़ के रूप में आणविक जीवविज्ञान अनुप्रयोगों के लिए एक मंच के रूप में की जरूरत है. महत्वपूर्ण बात, आनुवंशिक जोड़तोड़ transgenesis के माध्यम से चूहों में vivo में किया जा सकता है या AAV जीन वितरण तकनीक8 का उपयोग करके ताकि अलग प्राथमिक कोशिकाओं को पहले से ही आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जाएगा । चूहों9,10, चूहों11,12,13, कुत्ते14, खरगोश15,16, और मानव 17 से प्राथमिक गुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं का अलगाव ,18 शुद्ध समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं उपज के लिए शुद्धिकरण कदम के साथ सूचित किया गया है । इन पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल है कि समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं के अलगाव पर ध्यान केंद्रित में, ढाल केंद्रापसारक और छंटाई प्रयोगों शुद्धि प्रयोजनों के लिए प्रदर्शन किया गया19। जबकि इन प्रोटोकॉल समीपस्थ नलिकाओं अध्ययन के लिए मूल्यवान हैं, वे पर्याप्त नहीं है जब दोनों समीपस्थ और बाहर नलिकाओं अध्ययन किया जा करने के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, Alport सिंड्रोम पर हमारे अध्ययन से पता चला है कि दोनों समीपस्थ और बाहर गुर्दे नलिकाओं रोग प्रगति20में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और इसलिए गुर्दे नलिकाओं के दोनों प्रकार के संस्कृति में जांच की जानी चाहिए । गुर्दे फ्लोराइड विषाक्तता पर हाल के एक अध्ययन में यह भी दिखाया गया है कि रोग परिवर्तन दोनों समीपस्थ और बाहर नलिकाओं21में जगह ले ली. इसलिए, इस आइसोलेशन प्रोटोकॉल डिज़ाइन किया गया है और एक न्यूनतम लागत वाले एजेंट और सरल प्रक्रियाओं के साथ माउस गुर्दे से समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कक्षों दोनों के लिए अनुकूलित । वैकल्पिक रूप से, जांचकर्ता अभी भी कदम ३.१ जब तक प्रोटोकॉल का पालन करें और शुद्ध समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस बिंदु आगे से शुद्धि चरण9 जोड़ सकते हैं ।
अलग कोशिकाओं उच्च ऊर्जावान स्तर मौजूद है और 4 मार्ग को उप संस्कृतियों के बाद गुर्दे उपकला विशेषताओं को बनाए रखने. एक उच्च प्रवाह extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करना, हम एक ९६-well थाली में अलग TECs में सीधे mitochondrial श्वसन का आकलन है, जो कोशिका घनत्व अनुकूलन में आगे अंतर्दृष्टि की ओर जाता है । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल गुर्दे TECs के एक सुसंगत, अच्छी तरह से मानकीकृत उत्पादन के साथ गुर्दे ट्यूबलर पूर्व vivo अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का एक जोड़ा महत्व गुर्दे समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कोशिकाओं में mitochondrialता के पूर्व vivo लक्षण वर्णन के लिए एक उच्च प्रवाह उपकरण के रूप में अपनी व्यवहार्य उपयोग है । इसलिए, यह दवा की खोज या गुर्दे विकारों की दवा लक्षण वर्णन प्रयोजनों के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
हम एक प्रोटोकॉल है कि माउस गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (TECs) के कुशल अलगाव के लिए अनुमति देता है अनुकूलित और पता चला है कि कोशिकाओं को उप हो सकता है एक extracellular फ्लक्स विश्लेषण के लिए संस्कृति के लिए फैटी एसिड की उपस्थिति में mitochondrial श्वसन का मूल्यांकन- और/या ग्लूकोज आधारित सब्सट्रेट । इस प्रोटोकॉल दोनों समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित कर अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है और एक रूपरेखा के साथ जो टेक विकृति से जुड़े गुर्दे की बीमारियों की समझ के लिए और अधिक जटिल प्रयोगों के निर्माण के लिए कार्य करता है । पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में9,10,19, इस विधि लंबे समय केंद्रापसारक समय या छंटाई के लिए एक पर्याप्त एंटीबॉडी उपयोग के साथ ढाल जुदाई की आवश्यकता नहीं है और इसलिए, एक अधिक प्रदान करता है गुर्दे ट्यूबलर चयापचय क्षेत्र में काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए कुशल और अनुकूलित गाइड. इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, पाचन सहित, पुनः संग्रह, और चढ़ाना घनत्व और extracellular फ्लक्स परख के लिए यौगिक अनुकूलन ।
collagenase और इष्टतम एकाग्रता का सही प्रकार का चयन एक सफल पाचन और गुर्दे के ऊतकों से ट्यूबलर कोशिकाओं के पृथक्करण की कुंजी है । collagenases के अन्य प्रकारों की तुलना में, टाइप 2 collagenase को छेड़ने वाली गतिविधि के अपेक्षाकृत उच्च स्तर होते हैं, dissociating कॉम्पैक्ट गुर्दे संरचनाओं में सक्षम होते हैं । प्रदूषित होने की संभावना को कम करने के लिए एक लंबे समय तक छिड़काव और पाचन समय का एक परिणाम के रूप में, ०.०१३% प्रकार 2 collagenase पर perfused था 30 एमएल/ गुर्दे कैप्सूल केवल दोनों गुर्दे जानवर से काटा गया था और एक निष्फल सेल संस्कृति हुड में स्थानांतरित करने के बाद हटा दिया गया था । गुर्दे छोटे टुकड़ों में भरती किया गया और एक पूर्ण पाचन और ट्यूबलर कोशिकाओं के अधिक से अधिक रिहाई के लिए एक और 5 मिनट के लिए एक पाचन बफर के 10 मिलीलीटर के साथ उनकी गर्मी जारी रखा ।
हालांकि, पाचन के बाद, ऊतक निलंबन एक ७० के माध्यम से पारित कर दिया है-µm फिल्टर बहुत बड़े ऊतक टुकड़े को दूर करने के लिए, वहाँ अभी भी पच नलिकाओं कि फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं और सेल निलंबन के भीतर रहने और संस्कृति पकवान पर चढ़ाया जाना होगा. यह इन नलिकाओं के लिए सामांय से अधिक समय लगता है ट्यूबलर कोशिकाओं को जारी करने और संस्कृति पकवान को मजबूती से देते हैं । इसलिए, यह बजाय सेल निलंबन इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस सेल चढ़ाना के बाद unattached नलिकाओं और कोशिकाओं दूसरे दिन गोली करने के लिए केंद्रापसारक । यह कम गति के केंद्रापसारक कदम आगे अंय कोशिका प्रकार है कि ट्यूबलर कोशिकाओं की तुलना में हल्का कर रहे है और unattached नलिकाओं और ट्यूबलर कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है निकालता है ।
उचित कोशिका घनत्व की पहचान एक सफल extracellular फ्लक्स परख के लिए पहला और महत्वपूर्ण कदम है । परिणाम से पता चला है कि एक XF96 microplate पर अच्छी तरह से प्रति ४०,००० कोशिकाओं दोनों एक फैटी एसिड में प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं के लिए आदर्श है और एक ग्लूकोज आधारित श्वसन परख (3 सी आंकड़ा) । इस प्रोटोकॉल में, पृथक ट्यूबलर कोशिकाओं extracellular फ्लक्स परख के लिए मार्ग 1 और 2 में इस्तेमाल किया गया । कोशिकाओं उप-3 बीतने के लिए संस्कृति, हालांकि वे ट्यूबलर मार्करों की अभिव्यक्ति बनाए रखा (चित्रा 2) और एक सभ्य प्रदर्शन में ऊर्जा की परख (3 ए आंकड़ा), और दिखाया कम बेसल श्वसन स्तर की तुलना में 2 पारित करने के लिए (चित्रा 3 सी के rightmost पैनलों में ओसीआर की तुलना करके दिखाया गया है) । इस कमी काफी स्वस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं को प्रभावित नहीं कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, लोगों को युवा जंगली प्रकार चूहों से अलग). हालांकि, सीकेडी माउस मॉडल है कि पहले से ही एक कम mitochondrial श्वसन, कोशिकाओं के उच्च मार्ग है से पृथक कोशिकाओं पर अध्ययन के लिए बेसल श्वसन जो extracellular फ्लक्स परख के परिणामों को प्रभावित करेगा में एक और कमी का कारण हो सकता है । यहां किए गए अध्ययनों में, दोनों मार्ग 1 और मार्ग 2 से कोशिकाओं उच्च बेसल श्वसन स्तर दिखाया । इसलिए, इस प्रोटोकॉल के बाद, हम दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त पशुओं से पृथक कोशिकाओं के साथ mitochondrial श्वसन अध्ययन के लिए इन दो प्रारंभिक मार्ग का उपयोग करने की सलाह देते हैं । 2 पारित होने से कोशिकाओं को अभी भी ध्यान में रखा जाना चाहिए अगर पारित 1 उप संस्कृति प्रवाह परख के लिए पर्याप्त कोशिकाओं उपज नहीं है । इस अध्ययन के अलावा, हमारे पिछले अनुसंधान से पता चलता है कि 3 गद्यांश में प्राथमिक TECs प्रोटीन और आरएनए अध्ययन के बाद यौगिकों के साथ उपचार के लिए अत्यंत उपयोगी हो सकता है (दिखाया नहीं डेटा). यह कहा जा रहा है, हमारा सुझाव है कि जांचकर्ताओं इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने ट्यूबलर कोशिकाओं को अलग सावधानी से विभिंन अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम मार्ग चुनना चाहिए ।
extracellular फ्लक्स विश्लेषण के कार्य सिद्धांत इंजेक्शन यौगिकों और श्वसन श्रृंखला परिसरों और unयुग्मक के प्रभाव के बीच बातचीत पर आधारित है । । Oligomycin परिसर वी (एटीपी सिंथेस) के एक अवरोधक है और एटीपी से जुड़े ऑक्सीजन की खपत और ऑक्सीजन की खपत है कि एक mitochondrial भीतरी झिल्ली३२भर में नियमित रूप से प्रोटॉन रिसाव को दूर करने के लिए आवश्यक है भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है । FCCP से mitochondrial झिल्ली की क्षमता में खलल पड़ने से एटीपी प्रोडक्शन से आक्सीजन की खपत होती है । इस प्रकार, यह अधिक से अधिक श्वसन क्षमता का माप प्रदान करता है क्योंकि यह एटीपी सिंथेस द्वारा एक प्रोटॉन आयन समाप्ति की सीमित क्षमता को झिल्ली के माध्यम से एक प्रोटॉन परिवहन की अनुमति देकर दरकिनार कर देता है । Antimycin-ए, एक जटिल III अवरोध करनेवाला, और रोटेनोन, एक जटिल मैं अवरोधक, संयोजन में प्रयोग किया जाता है नीचे पूरे mitochondrial श्वसन mitochondrial बनाम गैर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत के बीच एक भेदभाव की अनुमति बंद कोशिकाओं । इन यौगिकों हमेशा extracellular फ्लक्स परख से पहले एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए titrated होना चाहिए इष्टतम सांद्रता कि उपज इष्टतम ओसीआर घटता निर्धारित करने के लिए । यहां, हम oligomycin के 1 µ m, FCCP के 1 µ m, और µ/रोटेनोन के 2 antimycin मीटर प्राथमिक extracellular पर TECs फ्लक्स परख के लिए सलाह देते हैं ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल mitochondrial पूर्व vivoका आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि गुर्दे प्राथमिक समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है. हालांकि इस प्रोटोकॉल आणविक जीव विज्ञान गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के जैविक समारोह की खोज अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोगी हो सकता है, हम अपनी सीमाओं को स्वीकार जब यह शुद्ध समीपस्थ या बाहर नलिकाओं की जरूरत अध्ययन करने के लिए आवेदन । उदाहरण के लिए, लोव सिंड्रोम पर अध्ययन, एक चयनात्मक समीपस्थ ट्यूबलर रोग३३, या बाहर गुर्दे ट्यूबलर दाखवते पर अध्ययन, एक बाहर ट्यूबलर रोग३४, सेल अलगाव के लिए एक और अधिक परिष्कृत प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी और शोधन. हालांकि, अध्ययन है कि नलिकाओं बनाम glomeruli की तुलना के बहुमत के लिए, और अध्ययन के लिए सामांय में ट्यूबलर कोशिकाओं में संभावित mitochondrial श्वसन नियामकों स्क्रीन करने के लिए, प्रोटोकॉल एक व्यवहार्य उच्च प्रवाह दृष्टिकोण प्रदान करता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल mitochondrial दवा खोज या लक्ष्य सत्यापन प्रयोजनों के लिए गुर्दे विकारों के साथ जुड़े रोग का अध्ययन करने के लिए व्यापक अनुप्रयोगों हो सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए निंनलिखित अनुदान द्वारा समर्थित था लीना Shehadeh: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R56HL132209 और 1R01HL140468) और मियामी हार्ट रिसर्च इंस्टीट्यूट ।
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |