Protéine fluorescente verte bibloc pour visualiser les effecteurs livré de bactéries lors de l’Infection
Summary
Approches protéine fluorescentes pour surveiller les effecteurs sécrétées par des bactéries dans les cellules hôtes sont difficiles. Cela est dû à l’incompatibilité entre protéines fluorescentes et le système de sécrétion de type III. Ici, un système GFP superfolder split optimisé est utilisé pour la visualisation des effecteurs sécrétées par des bactéries dans la cellule de plante hôte.
Abstract
Bactéries, parmi les plus importants agents causals de diverses maladies des plantes, sécrètent un ensemble de protéines effectrices dans la cellule de plante hôte pour subvertir le système immunitaire de plante. Au cours de l’infection effecteurs cytoplasmiques sont livrés dans le cytosol hôte via un type de système de sécrétion III (T3SS). Après l’accouchement dans la cellule végétale, les effecteurs cible le (s) spécifiques pour moduler les processus hôtes de cellule de survie et de la réplication de l’agent pathogène. Bien qu’il y a eu quelques recherches sur la localisation subcellulaire des protéines effectrices dans les cellules hôtes pour comprendre leur fonction dans la pathogénicité en utilisant des protéines fluorescentes, enquête sur la dynamique des effecteurs directement injectés des bactéries a été difficile en raison de l’incompatibilité entre la T3SS et des protéines fluorescentes.
Nous décrivons ici notre méthode récente d’un système de protéine fluorescente verte de superfolder (sfGFPOPT) split optimisé pour visualiser la localisation des effecteurs envoyées via la T3SS bactérienne dans la cellule hôte. Le sfGFP11 (11ème β-brin de sfGFP)-effecteur Taggé sécrétée par le biais de la T3SS peut être assemblé avec un organite spécifique cibléOPT sfGFP1-10 (1-10th β-brin de sfGFP) menant à l’émission de fluorescence sur le site. Ce protocole prévoit une procédure permettant de visualiser le signal de fluorescence sfGFP reconstitué avec une protéine effectrice de Pseudomonas syringae dans un organite particulier chez les plantes Arabidopsis et Nicotiana benthamiana .
Introduction
Les plantes sont des organismes sessiles que rencontrent de nombreux pathogènes envahisseurs, y compris les bactéries, champignons, virus, insectes et nématodes tout au long de leur cycle de vie. Parmi les phytopathogènes, les bactéries pathogènes Gram négatifs telles que Pseudomonas spp. et Ralstonia spp., infecter leurs plantes hôtes en entrant par le biais de plaies ou d’ouvertures naturelles, comme les stomates et hydathode1. Pour coloniser les plantes hôtes avec succès, les bactéries pathogènes ont évolué pour développer une variété de facteurs de virulence2. Lorsque les bactéries envahissent une plante hôte, ils injectent une série de protéines de virulence — appelés effecteurs — directement dans les cellules végétales pour promouvoir leur pathogénicité. Ces effecteurs suppriment ou modulent l’immunité innée de la plante et de manipulent les processus cellulaires de l’hôte pour aboutir à la survie bactérienne3.
Bactéries pathogènes utilisent principalement un T3SS pour fournir des protéines effectrices directement dans hôte cellules4. Le T3SS ressemble à une seringue moléculaire avec un canal aciculaires raccordement d’une structure de protéine d’échafaudage entre l’intérieur et les membranes bactériennes externes vers le site de l’injection des cellules hôte5. Ce mécanisme de sécrétion de médiation T3SS effecteur (T3E) est bien conservée dans diverses bactéries pathogènes Gram négatifs de la plante mais aussi humaine. L’un des agents pathogènes végétaux de représentative, le P. syringae pv. Tomate DC3000 CRHC mutant qui a généralement un T3SS défectueux, a limité la croissance des plantes, probables en raison de l’incapacité de ce mutant pour supprimer entièrement les plantes l’immunité (par l’injection de protéines effectrices)6. Sur la translocation dans les cellules de l’hôte, effecteurs ciblent diverses protéines de l’hôte qui sont importants pour le système de cellule hôte, y compris les réactions de défense des plantes, la transcription de gènes, la mort cellulaire, du protéasome, trafic vésiculaire et hormone voies7 , 8 , 9 , 10. suivi de la localisation cellulaire des protéines effectrices dans les cellules de l’hôte est donc une cible attractive pour comprendre leurs fonctions en ce qui concerne la modulation de l’immunité de la plante.
La plupart des études de localisation de la T3Es ont employé la surexpression agrobactérie –négociée avec une protéine de fluorescence grande plante hôte9. Toutefois, la méthode d’expression hétérologue pour les gènes qui sont introduites dans d’autres espèces s’est avérée être mal localisées ou parfois dysfonctionnement11,12,13. En outre, plusieurs études ont révélé que les effecteurs bactériennes subissent aucune modification pour le ciblage approprié dans les cellules de l’hôte14,15,16,17. Par conséquent, transitoirement exprimé effecteurs dans le cytosol de l’usine de cellules ne peuvent pas être fonctionnellement ou quantitativement identiques pour les effecteurs qui sont livrés par le T3SS sur pathogène infection18. En outre, la fusion de grandes marques fluorescentes protéines effectrices susceptible de perturber le bon effecteur livraison et visualisation18,19. Par conséquent, ces approches pour analyser la fonction T3E ne reflètent pas pleinement la localisation native des effecteurs T3SS-sécrétée.
Une protéine fluorescente verte (GFP) est composée de 11 brins β-tonneau enfermant un brin central qui comprend un chromophore20. Waldo et al. signalé un système nouveau split-GFP qui consiste en une petite composante (GFP β chapelet 11 ; GFP11) et un grand fragment complémentaire (volet GFP β 1-10 ; GFP1-10)21. Les fragments de n’y pas de fluorescence par eux-mêmes mais sont fluorescents sur leur autoassociation lorsque les deux fragments sont très proches entre eux. Pour l’optimisation de l’efficacité de pliage de protéine, les variantes pliants robustes de la GFP, c’est-à-dire, sfGFP et sfGFPOPT, ont été développés par la suite le split GFP système20,21,22. Récemment, le seul acide aminé muté variantes de sfGFP1-10OPT– sfYFP1-10OPT et sfCFP1-10OPT– qui peut reconstituer avec un fragment de sfGFP11 et voir la fluorescence de jaune et cyan, respectivement, ont généré23 . En outre, sfCherry, un dérivé de mCherry, peut être divisé en fragments sfCherry1-10 et sfCherry11 de la même manière que sfGFP23.
Ce système a été adapté d’étiqueter et de suivre les effecteurs T3SS dans les cellules HeLa au cours de l’infection en utilisant les effecteurs de Salmonella24. Toutefois, il a été précédemment pas optimisé pour le système plante-bactérie pathogène hôte. Récemment, nous avons optimisé le système GFP split basé sur l’amélioration de sfGFP1-10OPT pour surveiller la localisation subcellulaire de la T3Es envoyées de P. syringae en usine cellules25. Afin de faciliter les études de localisation de la T3Es aux différents compartiments subcellulaires dans les cellules végétales, un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana plantes ont été générés pour exprimer sfGFP1-10OPT dans les divers compartiments subcellulaires 25. par ailleurs, les plasmides portant une variété d’organite ciblées sfGFP1-10OPT pour l’ Agrobacterium-médiation surexpression transitoire et les vecteurs sfGFP11-tag pour la prestation de base T3SS effecteur ont également générés. Les graines de diverses lignées transgéniques de Arabidopsis et les plasmides d’exprimer les T3Es d’intérêt peuvent provenir de sources mentionnées dans la Table des matières26,,27.
Dans le protocole suivant, nous décrivons un système optimisé pour suivre la dynamique des effecteurs envoyées par des bactéries dans les cellules de l’hôte en utilisant le système de sfGFP de split. Infection des plantes exprimant sfGFP1-10OPT avec transgéniques Pseudomonas plasmide recombinant sfGFP11 se traduit par une livraison de l’effecteur sfGFP11-tag de Pseudomonas dans la cellule hôte. Par conséquent, ces protéines sont reconstituées et effectuer des transferts à la cible (s) à des effecteurs spécifiques. Le Pseudomonas syringae pv. tomate CUCPB5500 souche dont 18 effecteurs sont supprimées, a été utilisé parce que cette souche ont montré peu ou pas la mort cellulaire dans les a. thaliana et N. benthamianas28. Cependant, tous les matériaux et les étapes décrites ici peuvent être remplacé ou modifié pour adapter le système de sfGFP de split pour enquête d’autres questions biologiques ou l’optimisation des conditions de laboratoire donné.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est utilisé pour surveiller la localisation précise des protéines effectrices injecté par la T3SS bactérienne dans la cellule végétale hôte à l’infection. Auparavant, le bibloc GFP a été utilisé comme un outil pour étudier la localisation sous-cellulaire des protéines de mammifères23,36, Salmonella T3E localisation et Agrobacterium VirE2 livraison par l’entremise de le T4SS dans la 37…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par la base Science Research Program grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future (FRO-2018R1A2A1A05019892) DC et par une subvention du centre de reproduction végétale moléculaire ( PMBC) du programme de prochaine génération Biogreen 21 de l’Administration du développement Rural (PJ013201) d’ép. Nous remercions le centre d’imagerie du Centre National de Instrumentation de gestion de l’environnement fournir un microscope confocal pour le tournage.
Materials
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP | |
Riferimenti
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