成像 Ca2 +在志贺菌感染上皮细胞期间的响应

Summary

在这里, 我们提出的协议, 可视化钙 (Ca^{2 +}) 的反应引起的 HeLa 细胞感染, 由志贺菌。通过对 ca^{2 +}荧光探针的细菌感染和成像参数进行优化, 提出了由细菌引起的非典型全局和局部 Ca^{2 +}信号在大范围的感染动力学中的特征。

Abstract

Ca^{2 +}是所有已知的蜂窝进程中普遍存在的一个离子。尽管全局 Ca^{2 +}响应可能会影响细胞的命运, 但在自由 Ca^{2 +}胞浆浓度的局部变化中, 与内部存储区的释放有关, 或者通过等离子膜通道流入, 调节皮层细胞的过程。附着或侵入宿主细胞的病原体触发了宿主血浆膜肌动蛋白细胞骨架的重组, 这可能会影响全局和局部 Ca^{2 +}信号。由于这些事件可能以伪随机方式出现在扩展动力学上, 因此, 分析由病原体引起的 Ca^{2 +}信号会引发需要解决的重大技术挑战。

在这里, 我们报告的协议, 以检测全球和本地 Ca^{2 +}信号后,志贺菌感染上皮细胞。在这些协议中, 与 Ca^{2 +}荧光探针的激发相关的长时间暴露和光损伤关联的手工制品诊断在志贺菌入侵。在使用化学探针 Fluo-4 对扩展感染动力学过程中的全局胞浆 Ca^{2 +}信号的振幅和频率进行严格分析的过程被实施。

Introduction

Ca^{2 +}调节所有已知的单元进程, 包括骨架重组、炎症反应和与宿主-病原体相互作用有关的细胞死亡通路^1,2,3。在生理条件下, 基底胞浆 Ca^{2 +}浓度低, 在数以百计的 nM 范围内, 但可能会受到瞬变增加后激动剂刺激。这些变化经常表现出振荡行为, 通过泵和渠道在血浆和内质网膜的作用。这些振荡的模式以 ca^{2 +}的周期、持续时间和振幅为特征, 并由单元格进行解密, 然后在被称为 Ca^{2 +}代码^4,5 中触发特定响应..在病理条件下, 胞浆 Ca^{2 +}浓度的持续增加可能导致与线粒体膜通透相关的细胞死亡, 并释放亲凋亡或坏死因子^{6, 7}。

志贺菌是细菌性痢疾的致病剂, 通过使用 III. 型分泌系统 (T3SS)^8、9, 将效应器注入宿主细胞, 侵入上皮细胞。志贺菌入侵宿主单元格与 T3SS 引发的本地和全局 Ca^{2 +}信号相关联。至于成孔毒素, T3SS translocon 插入宿主细胞膜, 并需要注入 T3SS 效应剂可能负责激活 PLC 和肌醇 (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3) 依赖 Ca^{2 +}释放。局部 PLC 刺激和聚合肌动蛋白在志贺菌入侵部位的聚集, 导致超持久的 InsP3-dependent Ca^{2 +}发行¹⁰。III. 型效应器 IpgD, 磷脂 45 bisphosphate (PIP2)-4-磷酸酶, 限制了局部 PIP2 量, 从而控制了可编程序控制器生成 InsP3 的可用基板的数量, 这有助于限制本地 Ca^{2 +}细菌入侵站点的响应^11,12。这些本地 Ca^{2 +}响应可能会导致在志贺菌入侵站点¹⁰的肌动蛋白聚合。但是, 由志贺氏引起的全局 Ca^{2 +}响应是细菌入侵过程不可缺少的, 但会触发连接蛋白 hemichannels 在等离子膜上的打开和胞外 ATP 的释放。车厢。以分泌方式释放的 ATP 将反过来刺激受感染细胞旁边的单元格中的 Ca^{2 +}振荡响应。IpgD 还负责将全局 Ca^{2 +}响应塑造为不稳定的孤立响应, 并具有缓慢的动态。最后, 在长时间的细菌感染后, IpgD 导致 InsP3-mediated Ca^{2 +}信号的抑制。通过对 ca^{2 +}信号的干扰, IpgD 延迟了与 ca^{2 +}相关的钙蛋白酶激活, 导致了焦点黏附结构的拆卸和感染细胞的过早脱离 13.

虽然 Ca^{2 +}信号涉及病机的关键方面, 但微生物的使用引发了一些在经典激动剂研究中没有遇到的技术挑战。此处描述的协议使用常用的荧光 Ca^{2 +}化学指标 Fluo-4, 我们在志贺病毒感染期间设计了用于表征本地 Ca^{2 +}信号的特性。讨论了对这些信号进行检测的关键步骤, 以及为进行定量分析所需的程序, 以确定细菌效应在 Ca^{2 +}信号中的作用。

Protocol

1. 筹备工作 细菌制剂 板细菌-志贺菌野生型菌株, 表达 AfaE 黏附 (M90T AfaE)-在胰酪胨大豆 (TCS) 琼脂板上含有0.01% 刚果红 (CR) 和孵化他们18小时37摄氏度。注意: 为了提高其重现性, 在步骤1.1.1 中获得的志贺菌板块储存在4摄氏度, 应在一周内使用, 因为 CR 培养基上的所有菌落最终会随着时间而变红。 接种 TCS 肉汤前培养, 从条纹板采摘3红殖民地。?…

Representative Results

志贺菌入侵与非典型的持久性本地 Ca2 +响应关联: 根据上述协议, Fluo-4-loaded HeLa 细胞受到了志贺菌的挑战, 并进行了流采集以分析 Ca2 +信号。一个具有代表性的实验显示在图 1中, 其中的时间推移图像系列的荧光强度的 Fluo-4 探针平均在一个区域感兴趣的一个单元, 和相应的相位?…

Discussion

本手稿描述了在志贺菌入侵的相对较短的动力学过程中, 我们设计为遵循本地 ca^{2 +}信号的协议, 以及志贺菌扩展动力学过程中的全局 ca^{2 +}响应。下面, 需要解决的关键问题是优化 Ca^{2 +}信号的检测, 同时尽量减少对生物过程的任何干扰。

化学vs基因编码的 Ca^{2 +}探头:

为了图像本地 Ca^{2 +}的变化, 我们使用?…

Materials

Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin