Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer
Summary
Denne protokollen gir forskere med et nytt verktøy for å overvåke gjengivelsen av transkripsjon i flere modell organismer.
Abstract
Nøyaktig transkripsjon kreves for trofast uttrykket av genetisk informasjon. Overraskende skjønt, lite er kjent om mekanismer som styrer gjengivelsen av transkripsjon. For å fylle dette hullet i vitenskapelig kunnskap, optimalisert vi nylig sirkel-sekvensering analysen å oppdage transkripsjon feil gjennom transcriptome av Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokollen gir forskere med et kraftig nytt verktøy for å kartlegge landskapet i transkripsjon feil i eukaryote celler slik at mekanismene som styrer gjengivelsen av transkripsjon kan bli belyst i enestående detaljer.
Introduction
Genomet gir en presis biologiske blåkopi av livet. For å implementere dette blåkopi riktig, er det viktig for genomet å bli transkribert med stor presisjon. Men er transkripsjon usannsynlig å være feilfri. For eksempel RNA polymerases har lenge vært kjent for å være utsatt for feil i vitro1,2, og nylig ble det vist at de begår feil i vivo samt3,5,6, spesielt når konfrontert med DNA skade7,8,9,10. Sammen indikerer disse observasjonene at transkripsjon feil oppstår kontinuerlig i alle levende celler, antyder at de kunne være en potent kilde til mutert proteiner.
Denne prosessen kalles transcriptional mutagenese, er forskjellig fra klassisk mutagenese på to måter. Først, i motsetning til genetiske mutasjoner, transkripsjon feil påvirke både mitotisk og post mitotisk celler, som de ikke avhengige av utryddelse. Studere mekanismer som påvirker gjengivelsen av transkripsjon vil derfor gi verdifull innsikt i mutasjon belastningen av både mitotisk og post mitotisk celler. Interessant, transkripsjon feil har nylig vært innblandet i markedsføringen av protein aggregering11,12,13 og har vært antatt bidra til både kreft10 og utvikling av antibiotikaresistens i bakterier14.
Andre, i motsetning til genetiske mutasjoner, transkripsjon feilene er forbigående i naturen. Deres midlertidig eksistens er spesielt utfordrende fordi det gjør transkripsjon feil meget vanskelig å oppdage. For eksempel, mens flere labs har utviklet verdifulle reporter analyser for studiet av transcriptional mutagenese, er disse analyser bare kjøpedyktig mål transkripsjon feil i noen sammenhenger og modell organismer4,15. For å overvinne disse begrensningene, har mange forskere slått til RNA sekvensering teknologi (RNA-seq), som tillater teoretisk transkripsjon feil skal registreres gjennom transcriptome av alle arter. Men er disse studiene lett forvirret av biblioteket bygging artefakter som omvendt transkripsjon feil, PCR forsterkning feil og feilutsatte natur sekvensering selv. For eksempel lagre omvendt transcriptases omtrent én feil hver ~ 20.000 baser, mens RNA polymerases (RNAPs) er forventet å gjøre bare én feil hver 300.000 baser5,6. Fordi feilrate omvendt transkripsjon alene dverger feilrate av RNA polymerases i cellene, er det praktisk talt umulig å skille ekte transkripsjon feil fra biblioteket forberedelse i tradisjonelle RNA-Seq data ( objekter Figur 1a).
For å løse dette problemet, utviklet vi en optimalisert versjon av den sirkel-sekvensering (Cirseq eller C-seq heretter) analysen5,16. Denne analysen kan brukeren finne transkripsjon feil og andre sjeldne varianter i RNA i transcriptome5. Rundskriv-sekvensering analysen bærer dette navnet fordi et viktig skritt i denne analysen dreier RNA circularization. Når RNA mål er circularized, er de omvendt transkribert i et bølgende sirkel mote, å produsere lineær cDNA molekyler som inneholder mange kopier av den samme RNA-malen. Hvis feilen var i en av disse malene, vil denne feilen også være til stede i hvert enkelt gjenta i cDNA molekylet. Derimot feilene som omvendt transkripsjon, PCR forsterkning eller sekvensering pleier å oppstår tilfeldig, og vil dermed være tilstede i bare én eller to ganger. Dermed generere en konsensus sekvens for hvert cDNA molekyl, og skille tilfeldige feil fra feil som forekommer i alle rapportene, kan bibliotek bygging gjenstander effektivt være adskilt fra sant transkripsjon feil (figur 1b).
Hvis brukt riktig, C-seq analysen kan brukes til nøyaktig oppdage frekvensen av base erstatninger, innsettinger og slettinger i RNA gjennom transcriptome av alle arter (for eksempel se traversering og Ochman17). For eksempel har vi brukt C-seq analysen gi genomet hele målinger av feilrate transkripsjon i Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans én base oppløsning5 (upublisert observasjoner). Opprinnelig brukt til å nøyaktig sekvens RNA-virus befolkninger, har denne optimalisert versjon av C-seq analysen blitt strømlinjeformet for å minimere værharde under bibliotek utarbeidelsen som bidrar til biblioteket bygging gjenstander. I tillegg bruker en rekke kommersielt tilgjengelige kits, er gjennomstrømningen av analysen kraftig forbedret, og dens brukervennlighet. Hvis brukt riktig, kan denne analysen nøyaktig oppdage tusenvis av transkripsjon feil per replikere, og dermed sterkt forbedre tidligere studier6. Total, denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere transcriptional mutagenese og vil tillate brukeren å få ny innsikt i mekanismer som styrer gjengivelsen av transkripsjon i et bredt spekter av organismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en optimalisert protokoll for utarbeidelse av C-seq biblioteker for påvisning av transkripsjon feil i Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokollen har mange fordeler over eksisterende protokoller, samt alternative teknikker.
De siste 15 årene, har mange reporter systemer utviklet som bruker luciferase7,8 eller grobunn-Lox rekombinasjon<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne publikasjonen ble gjort mulig med midler fra grant T32ES019851 (til C. Fritsch), gi R01AG054641 og AFAR unge etterforsker (til M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
Riferimenti
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
