Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer
Summary
Detta protokoll ger forskare med ett nytt verktyg för att övervaka trohet transkriptionen i flera modellorganismer.
Abstract
För ett troget uttryck för genetisk information krävs korrekt transkription. Överraskande men lite är känt om de mekanismer som styr trohet transkriptionen. För att fylla denna lucka i vetenskaplig kunskap, optimerad vi nyligen cirkel-sekvensering analysen för att upptäcka transkription fel i hela transkriptom av Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans. Detta protokoll kommer att ge forskare med ett kraftfullt nya verktyg för att kartlägga landskap av transkription fel i eukaryota celler så att de mekanismer som styr trohet transkriptionen kan belysas i oöverträffad detaljrikedom.
Introduction
Genomet ger en exakt biologiska blåkopia av liv. För att genomföra denna blåkopia korrekt, är det viktigt för genomet att transkriberas med stor precision. Transkription är dock osannolikt att vara felfri. Till exempel RNA polymeraser har länge varit känt att vara felbenägen in vitro-1,2, och nyligen det visades att de begår fel i vivo samt3,5,6, särskilt när de konfronteras med DNA skada7,8,9,10. Sammantaget tyder dessa observationer på att transkriptionen fel uppkomma kontinuerligt i alla levande celler, vilket tyder på att de kunde vara en potent källa av muterade proteiner.
Denna process kallas transkriptionell mutagenes, skiljer sig från klassisk mutagenes på två sätt. Först, i motsats till genetiska mutationer, transkription fel påverkar både mitotiska och efter mitotiska celler, som de inte beror på DNA-replikation. Studera de mekanismer som påverkar trohet transkriptionen kommer därför att ge värdefulla insikter om mutationen belastningen av både mitotiska och efter mitotiska celler. Intressant, transkription fel har nyligen varit inblandade i främjandet av protein sammanläggning11,12,13 och har varit en hypotes om för att bidra till både carcinogenes10 och utveckling av antibiotikaresistens hos bakterier14.
Andra, till skillnad från genetiska mutationer, transkription fel är övergående. Deras tillfälliga existens är särskilt utmanande eftersom det gör transkription fel ytterst svår att upptäcka. Till exempel, medan flera labs har utarbetat värdefulla reporter analyser för studiet av transkriptionell mutagenes, finns dessa analyser endast kunna mäta transkription fel i ett begränsat antal sammanhang och modell4,15. För att övervinna dessa begränsningar, har många forskare vänt sig till RNA-sekvensering teknik (RNA-seq), som teoretiskt kan transkription fel registreras i hela transkriptom av alla arter. Dessa studier är dock enkelt ihop av bibliotek konstruktion artefakter, såsom omvänd Transkription fel, PCR-amplifiering fel och felbenägna beskaffenhet sekvensering själv. Till exempel begår omvänd transcriptases ungefärligt ett fel varje ~ 20.000 baser, medan RNA polymeraser (RNAPs) förväntas göra enda fel var 300.000 baser5,6. Eftersom felprocenten för omvänd Transkription ensam dvärgar felprocenten av RNA polymeraser inuti cellerna, är det nästan omöjligt att skilja sant transkription fel från artefakter som orsakas av bibliotek preparatet i traditionella RNA-Seq data ( Figur 1a).
För att lösa problemet, utvecklat vi en optimerad version av den cirkel-sekvenseringen (Cirseq eller C-seq hädanefter) analys5,16. Denna analys tillåter användaren att upptäcka transkription fel och andra sällsynta varianter i RNA under hela den transkriptom5. Cirkulär-sekvensering analysen bär detta namn eftersom ett viktigt steg i denna analys kretsar kring RNA circularization. När RNA målen är circularized, är de omvänd transkriberas i en rullande mode cirkel, att producera linjär cDNA molekyler som innehåller många kopior av samma RNA mall. Om ett fel var närvarande i en av dessa mallar, skulle detta fel också vara närvarande i varje enskild upprepning som finns inom cDNA molekylen. Däremot fel införs genom omvänd Transkription, PCR-amplifiering eller sekvensering tenderar att uppkomma slumpmässigt, och således finnas i endast en eller två repetitioner. Genom att generera en konsensus sekvens för varje cDNA molekyl, och särskilja slumpmässiga fel från fel som uppstår i alla repetitioner, kan således bibliotek konstruktion artefakter effektivt separeras från Sant transkription fel (figur 1b).
Om det används korrekt, C-seq analysen kan användas för att korrekt identifiera andelen bas substitutioner, infogningar och borttagningar i RNA under hela transkriptom av alla arter (exempelvis se Traverse och Ochman17). Till exempel har vi använt C-seq analysen för att förse genome-wide mätningar av felprocenten av transkription i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans med en enda bas resolution5 (opublicerade observationer). Ursprungligen användes korrekt sekvensera RNA-virus populationer, har detta optimerade versionen av C-seq analysen effektiviserats för att minimera hårda förhållanden under bibliotek förberedelsen som bidrar till biblioteket konstruktion artefakter. Dessutom, med hjälp av ett antal kommersiellt tillgängliga kit, förbättrad genomströmning av analysen väsentligt, samt dess användarvänlighet. Om det används korrekt, kan denna analys upptäcka tusentals transkription fel per replikat, därmed kraftigt förbättra på tidigare studier6. Sammantaget denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera transkriptionell mutagenes och tillåter att användaren att få nya insikter i de mekanismer som styr trohet transkriptionen i ett brett utbud av organismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett optimerat protokoll för beredning av C-seq bibliotek för detektion av transkription fel i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans. Detta protokoll har många fördelar jämfört med befintliga protokoll, liksom alternativa tekniker.
Under de senaste 15 åren, många reporter system har utvecklats som förlitar sig på Cre-Lox rekombination3,4,</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna publikation har möjliggjorts genom finansiering från grant T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641, och en AFAR unga utredare bevilja (M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
Riferimenti
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
