Сетчатки крио секции, целом кронштейны и гипотонический изолированных сосудистую подготовка к визуализации иммуногистохимических микрососудистой Pericytes
Summary
Мы показываем три методы приготовления различных тканей для визуализации иммуногистохимических сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.
Abstract
Сетчатки pericytes играют важную роль во многих заболеваний глаза. Иммуногистохимическое окрашивание методы сосудов сетчатки и микрососудистой pericytes являются центральными для офтальмологических исследований. Важно выбрать подходящий метод визуализации микрососудистой pericytes. Мы описываем сетчатки микрососудистой перицит иммуногистохимическое окрашивание в крио секции, всего кронштейны и гипотонической изолированных сосудистую, с использованием антител для тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Это позволяет нам подчеркнуть преимущества и недостатки каждого из трех ткани препаратов для визуализации сетчатки микрососудистой pericytes. Крио разделы обеспечивают transsectional визуализация всех слоев сетчатки, но содержат только несколько иногда поперечные срезы microvasculature. Целом гора обеспечивает обзор всей сетчатки сосудистую, но визуализация microvasculature может быть хлопотно. Гипотонический изоляции обеспечивает метод визуализировать всю сосудистую сетчатки, удаление нейрональных клеток, но это делает ткани очень хрупкие.
Introduction
Сетчатки pericytes находятся в центре внимания многих научно-исследовательских лабораторий, как эти клетки играют важную роль в целостности сосудистую. Патологических состояний, таких как диабетическая ретинопатия1, ишемия2и глаукомы3 имеют сосудистой характеристики, которые включают функцию pericytes. Pericytes находятся в внутренний сетчатки капиллярной сплетения. Центральной артерии сетчатки, которая поставляет внутреннюю сетчатки разветвляется на два слоя капиллярного сплетений. Внутренняя сосудистого русла находится между клеток ганглия и внутренние ядерного слои. Глубокий слой более плотным и сложных и локализуется между внутренней и наружной ядерных слои4,5. Кроме того некоторые части сетчатки также содержат третья сеть называется радиальной parapapillary капилляров. Эти длинные, прямые капилляров, которые лежат среди нервных волокон и редко анастомозируют с друг с другом или другие два сплетения6. В стенке капилляров pericytes встраиваются в базальной мембраны и линии с abluminal стороны сосудистой эндотелиальных клеток.
К этой дате существует не уникальный биологический маркер эти pericytes, которые могут дифференцировать их от других сосудистых клеток. Часто используемых маркеров, которые представляют на pericytes, но и другие сосудистые клетки тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Выявление pericytes еще больше осложняется существование перицит подмножеств, которые различаются по морфологии и белка выражение7. В настоящее время лучшие идентификации опирается на комбинацию белковых маркеров и характерным позиционирования перицит в сосудистой стенке. Мы демонстрируем здесь три методы приготовления различных тканей для иммуногистохимическое окрашивание PDGFRβ/NG2 сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.
С крио секции сетчатки и склера прорваться через зрительный нерв. Это позволяет для визуализации всех слоистых структур нейронов. Собственный десяти слоев сетчатки являются очевидными как Перепутывание ядерного и аксональной/дендритных структуры, которые могут быть визуализированы с пятнами как гематоксилином/эозином или флуоресцентные ядерной 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Метаболические требования отличаются между слоями9 и он предоставляет метод для определения толщины или полное отсутствие конкретного слоя (например, потеря клеток сетчатки ганглия является одной из отличительных особенностей сетчатки ишемии10, 11). Сосудистую очевиден, как поперечный прорезает сетчатки, что делает его возможным отдельно изучить капиллярного сплетения в соответствующих слоях сетчатки12,13.
Традиционно в целом сетчатки-монтирует проводятся исследования сетчатки сосудистую сеть. С подготовкой этой ткани Сетчатка вырезать и уплощенная как цветок shaped структуры. Метод представляет собой метод подготовки сравнительно быстро ткани, который можно выделить общую архитектуру сетчатки сосудистую и поэтому он часто применяется в расследовании неоваскуляризация в мышиных сетчатки. Успешной визуализации microvasculature в целом монтируется сетчатки также сообщается в развивающихся неонатальной мыши и крысы сетчатки14,,1516,17,18, 19. Эти исследования выявили более определенным pericytic активности с больших капиллярно свободно OBLASTей в взрослого, по сравнению с новорожденным сетчатки14.
Еще один способ визуализации является microvasculature сетчатки после гипотонический изоляции. Этот метод подготовки ткани приводит к сетчатки кровеносных сосудов и капилляров, освобождается нейрональных клеток. Этот тип двумерных изображений изолированной сетчатки сосудистой сети обычно выполняется после переваривания трипсином сетчатки20 и использованы для оценки сосудистые аномалии диабетической ретинопатии, включая потерю перицит и капиллярные 20,дегенерация21,22. Гипотонический изоляции метод предлагает расследования сетчатки сосудистого генов и белков регулирования ответы, как они было сделано с RT-PCR и западных blotting23,24,25. Здесь мы предоставляем протокол для свободно плавать иммуногистохимическое окрашивание гипотонический изолированных сетчатки сосудистую как альтернатива Пищеварение трипсина для изучения микрососудистой pericytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем три сетчатки подготовка техники, которые могут быть применены в исследовании микрососудистой pericytes сетчатки. Ниже мы предлагаем сравнение между каждым из методов и выделить важные шаги в протоколах.
С крио секционирование, сетчатки режется в сагиттально…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование финансировалось Lundbeck фонд, Дания.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Riferimenti
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
