कैंसर से संबंधित थकान में Mitochondrial समारोह की भूमिका का मूल्यांकन
Summary
हमारा लक्ष्य कैंसर रोगियों में थकान से जुड़ी mitochondrial शिथिलता का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल विकसित करना था । इस अभिनव प्रोटोकॉल नैदानिक केवल मानक phlebotomy और बुनियादी प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को शामिल उपयोग के लिए अनुकूलित है ।
Abstract
थकान एक आम और दुर्बल हालत है कि सबसे अधिक कैंसर रोगियों को प्रभावित करता है । तारीख करने के लिए, थकान खराब नहीं नैदानिक परीक्षण के साथ विशेषता के लिए होना चाहए इस हालत की गंभीरता को मापने रहता है । यहां हम थका हुआ कैंसर रोगियों से एकत्र PBMCs के mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन । एक कॉंपैक्ट extracellular फ्लक्स प्रणाली और श्वसन अवरोधकों के अनुक्रमिक इंजेक्शन का उपयोग करना, हम बेसल mitochondrial श्वसन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता को मापने के द्वारा PBMC mitochondrial कार्यात्मक स्थिति की जांच की, और ऊर्जा phenotype, जो वर्णन करता है पसंदीदा ऊर्जा मार्ग तनाव का जवाब । ताजा PBMCs मानक phlebotomy का उपयोग नैदानिक सेटिंग में आसानी से उपलब्ध हैं । पूरे इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख जटिल जैव रासायनिक तकनीकों की भागीदारी के बिना कम से 4 घंटे में पूरा किया जा सकता है । साथ ही, हम reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है एक सामान्यीकरण विधि का वर्णन करें । सरल प्रक्रिया और सामांयीकरण तरीके प्रस्तुत करने के लिए एक ही रोगी और reproducible डेटा है कि समय अंक के बीच की तुलना में संभावित उपचार प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है की पीढ़ी से दोहराया नमूना संग्रह के लिए अनुमति देते हैं ।
Introduction
थकान एक प्रचलित और चिंताजनक स्थिति है जिसका कैंसर रोगियों के जीवन की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है1. इस तिथि करने के लिए, कैंसर थकान खराब परिभाषित रहता है और केवल रोगियों द्वारा व्यक्तिपरक रिपोर्टिंग पर निर्भर करता है2। इसलिए, नैदानिक सेटिंग3,4में थकान विशेषता के लिए एक आसानी से अनुकूलनीय नैदानिक प्रयोगशाला परीक्षण की पहचान करने के लिए एक तत्काल जरूरत है.
कई अंतर्निहित तंत्र, mitochondria शिथिलता सहित,5थकान पैदा करने के लिए प्रस्तावित किया गया है । Mitochondria बिजलीघर organelles, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से सेलुलर ऊर्जा की जरूरत के ९५% प्रदान कर रहे हैं, और कैल्शियम सिग्नलिंग, apoptosis, प्रतिरक्षा संकेतन, और अन्य intracellular संकेतन घटनाओं के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा6 . तदनुसार, बिगड़ा mitochondrial ऊर्जा उत्पादन में ऊर्जावान और दोषों थकान में योगदान कर सकते हैं । इस परिकल्पना का समर्थन, पिछले अध्ययनों क्रोनिक थकान सिंड्रोम7के साथ रोगियों में mitochondrial डीएनए में उत्परिवर्तनों मनाया है । हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या थकान के pathophysiological मूल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र या परिधीय ऊतकों, कंकाल की मांसपेशियों के रूप में8,9के भीतर निहित है, वहां वर्तमान में कोई सीधा तरीका सही आकलन है जी, respiring कोशिकाओं में थकान से संबंधित mitochondrial शिथिलता.
mitochondrial समारोह का अध्ययन करने के लिए परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का उपयोग कई लाभ प्रदान करता है । सबसे पहले, PBMCs मानक phlebotomy का उपयोग कर नैदानिक सेटिंग में आसानी से उपलब्ध हैं और जल्दी से बुनियादी प्रयोगशाला तकनीकों का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. दूसरा, रक्त संग्रह इस तरह के एक मांसपेशी बायोप्सी के रूप में अन्य ऊतकों को इकट्ठा करने से कम आक्रामक है । इस प्रकार, रक्त के नमूनों को समय के साथ एक ही रोगी के बार से एकत्र किया जा सकता है, जो उपचार प्रभाव के अनुदैर्ध्य आकलन की सुविधा । दिलचस्प है, PBMCs में mitochondrial समारोह में अच्छी तरह से एक पशु मॉडल में गुर्दे mitochondrial स्थिति के साथ संबंधित होना दिखाई दिया10. इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिका mitochondria अलग रोग की स्थिति11,12के तहत प्रणालीगत परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया गया है । परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में Mitochondria विशेष रूप से प्रतिरक्षा कार्यों में परिवर्तन और प्रतिरक्षा संकेत अणुओं जैसे साइटोकिंस13,14,15के रूप में संवेदनशील होते हैं । उदाहरण के लिए, यह देखा गया है कि तीव्र आमवाती भड़काऊ रोगों के साथ रोगियों से PBMCs उच्च आधारभूत ऑक्सीजन खपत14प्रदर्शन. इसके विपरीत, ऑक्सीजन की खपत पूति16सहित प्रणालीगत भड़काऊ शर्तों के साथ रोगियों से अलग PBMCs में कम किया गया था । भड़काऊ शर्तों के तहत, बेकार mitochondria द्वारा उत्पादित मुक्त कण आगे ऑक्सीडेटिव तनाव और लंबे समय तक सूजन17में योगदान कर सकते हैं । ऊर्जा उत्पादन में mitochondria की केंद्रीय भूमिका के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऑक्सीडेटिव तनाव कैंसर रोगियों में थकान का अध्ययन करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में mitochondrial समारोह का उपयोग कर के संभावित उपयोगिता पता चलता है 13।
पिछले mitochondrial समारोह का परीक्षण अध्ययन जैव रासायनिक तकनीक का उपयोग किया, mitochondrial झिल्ली संभावित माप, या विशिष्ट कोशिका आबादी के अलगाव कि नैदानिक सेटिंग5में आसानी से अनुकूलनीय नहीं हो सकता है, 14,18. हाल के वर्षों में, extracellular फ्लक्स परख के विकास के शोधकर्ताओं ने अनुमति दी है आसानी से और सही ऑक्सीजन खपत दर में परिवर्तन की जांच (ओसीआर) श्वसन अवरोधकों के स्वचालित इंजेक्शन के लिए जवाब में,20 , 21 , 22. हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययनों को विशिष्ट कक्ष प्रकारों के लिए डिज़ाइन किया गया है और बड़े उच्च-प्रवाह स्वरूप एक नैदानिक सेटिंग में लागू नहीं हो सकता है । इस पांडुलिपि में, हम नैदानिक उपयोग के लिए mitochondrial समारोह की जांच के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर के रोगियों में थकान एक दुर्बल हालत है कि अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है या1विशेषता है । थकान का निदान पूरी तरह से व्यक्तिपरक रिपोर्टिंग पर निर्भर करता है और इस हालत के लिए कोई वर्तमान नैदा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के NIH, बेथेस्डा, मैरीलैंड के राष्ट्रीय नर्सिंग अनुसंधान संस्थान के अंदर अनुसंधान के विभाजन द्वारा पूरी तरह से समर्थित है ।
Materials
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
Riferimenti
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -. W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. . Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -. L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).
