Vurdere rollen mitokondrie funksjon i kreft relatert tretthet
Summary
Målet var å utvikle en praktisk protokoll for å evaluere mitokondrie dysfunksjon knyttet til trøtthet i kreftpasienter. Denne nyskapende protokollen er optimalisert for klinisk bruk involverer kun phlebotomy og grunnleggende laboratorium prosedyrer.
Abstract
Trøtthet er en felles og ødeleggende tilstand som påvirker de fleste kreftpasienter. Hittil test tretthet fortsatt dårlig preget med ingen diagnostisk å objektivt måle alvorlighetsgraden av denne tilstanden. Her beskriver vi en optimalisert metode for å vurdere mitokondrie funksjon av PBMCs fra trøtt kreftpasienter. Bruker en kompakt ekstracellulære forandring system og sekvensiell injeksjon av respiratoriske hemmere, undersøkte vi PBMC mitokondrie funksjonell status ved å måle basal mitokondrie respirasjon reservedeler åndedretts kapasitet og energi fenotype, som beskriver foretrukket energi veien svare på stress. Ferske PBMCs er lett tilgjengelig i klinisk setting med standard phlebotomy. Hele analysen beskrevet i denne protokollen kan gjennomføres på mindre enn 4 timer uten involvering av komplekse biokjemiske teknikker. I tillegg beskriver vi en normalisering metode som er nødvendig for å få reproduserbar data. De enkle prosedyren og normalisering metodene presentert tillater gjentatte prøvetaking fra samme pasient og generasjon av reproduserbar data som kan sammenlignes med mellom tidspunkt å vurdere potensielle behandling effekter.
Introduction
Trøtthet er en utbredt og sørgelig tilstand som har en negativ innvirkning på livskvaliteten kreft pasienter1. Til denne datoen, kreft trøtthet er fortsatt dårlig definert og bare avhengig av subjektive rapportering av pasienter2. Derfor er det et presserende behov for å identifisere en enkelt tilpasses diagnostisk laboratorietest objektivt betegner tretthet i klinisk setting3,4.
Flere underliggende mekanismer, inkludert mitokondriene dysfunksjon, foreslått å forårsake tretthet5. Mitokondrier er drivkraft organeller, gir 95% av mobilnettet energibehov via oxidative fosforylering, og spiller en viktig rolle i kalsium signalering, apoptose, immun signalering og regulering av andre intracellulær signalnettverk hendelser6 . Følgelig kan svekket mitokondrie bioenergi og defekter i energiproduksjon bidra til trøtthet. Støtter denne hypotesen, har tidligere studier observert mutasjoner i Mitokondrielt DNA hos pasienter med kronisk fatigue syndrome7. Mens det er uklart om patofysiologiske opprinnelsen til trøtthet ligger i sentralnervesystemet eller perifere vev, for eksempel skjelettmuskulatur8,9, finnes det for øyeblikket ingen direkte måte å vurdere nøyaktig Mitokondrielt dysfunksjon knyttet til trøtthet i live, respiring celler.
Hvis du bruker perifert blod mononukleære celler (PBMCs) for å studere mitokondrie funksjonen har flere fordeler. Først PBMCs er lett tilgjengelig i klinisk setting med standard phlebotomy og kan isoleres raskt ved hjelp av grunnleggende laboratorium teknikker. Andre er blod samling mindre invasiv enn å samle andre vev som en muskel biopsi. Dermed kan blodprøver hentes fra samme pasient gjentatte ganger over tid, som muliggjør langsgående vurdering av behandling effekter. Interessant, syntes mitokondrie funksjon i PBMCs å være godt korrelert med nyre mitokondrie status i en dyremodell10. Videre har immun cellen mitokondrier blitt brukt som en proxy for å oppdage systemisk endringer under forskjellige sykdom forhold11,12. Mitokondrier i sirkulerende immunceller er spesielt følsomme for endringer i immunforsvaret funksjoner og immun signalnettverk molekyler som cytokiner13,14,15. Det er for eksempel observert at PBMCs fra pasienter med akutt revmatiske inflammatoriske sykdommer ha høy planlagte oksygen forbruk14. Derimot ble oksygenforbruk redusert i PBMCs isolert fra pasienter med systemiske opphissende vilkårene inkluderer sepsis16. Under inflammatoriske tilstander, kan frie radikaler produseres av dysfunksjonelle mitokondriene ytterligere bidra til forhøyet oksidativt stress og langvarig betennelse17. Sentral rolle i mitokondrier i energiproduksjon og som oksidativt stress foreslår mulige nytten av funksjonen mitokondrie som en proxy for å studere tretthet i kreft pasienter 13.
Tidligere studier undersøke mitokondrie funksjonen benyttes biokjemiske teknikker, mitokondrie membran potensielle mål eller isolering av bestemt celle populasjoner som ikke kan være lett tilpasses i klinisk setting5, 14,18. De siste årene, utviklingen av ekstracellulære flux analyser har tillatt forskere til å enkelt og undersøke nøyaktig endringer i oksygen forbruksraten (OCR) svar på automatiserte injeksjoner av respiratoriske hemmere19,20 , 21 , 22. men de fleste av disse studiene er utformet for bestemte celletyper og store høy gjennomstrømming format kanskje ikke være tilgjengelig i en klinisk setting. I dette manuskriptet beskrive vi en optimalisert protokoll for å undersøke mitokondrie funksjon for klinisk bruk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trøtthet i kreftpasienter er en ødeleggende tilstand som ikke godt definert eller preget1. Diagnostisering av trøtthet er helt avhengig av subjektive rapportering og det er ingen gjeldende diagnostiske standarden eller behandling for denne tilstanden, hovedsakelig på grunn av mangel på forståelse i det pathobiology2. Av foreslåtte mekanismene bak trøtthet i kreftpasienter, er verdifall i mitokondrie funksjon en av de mest terapeutisk targetable. Derfor utviklet vi e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien er fullt støttet av delingen av Intramural forskning av National Institute for sykepleie forskning NIH, Bethesda, Maryland.
Materials
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
Riferimenti
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -. W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. . Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -. L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).
