Målet var å utvikle en praktisk protokoll for å evaluere mitokondrie dysfunksjon knyttet til trøtthet i kreftpasienter. Denne nyskapende protokollen er optimalisert for klinisk bruk involverer kun phlebotomy og grunnleggende laboratorium prosedyrer.
Trøtthet er en felles og ødeleggende tilstand som påvirker de fleste kreftpasienter. Hittil test tretthet fortsatt dårlig preget med ingen diagnostisk å objektivt måle alvorlighetsgraden av denne tilstanden. Her beskriver vi en optimalisert metode for å vurdere mitokondrie funksjon av PBMCs fra trøtt kreftpasienter. Bruker en kompakt ekstracellulære forandring system og sekvensiell injeksjon av respiratoriske hemmere, undersøkte vi PBMC mitokondrie funksjonell status ved å måle basal mitokondrie respirasjon reservedeler åndedretts kapasitet og energi fenotype, som beskriver foretrukket energi veien svare på stress. Ferske PBMCs er lett tilgjengelig i klinisk setting med standard phlebotomy. Hele analysen beskrevet i denne protokollen kan gjennomføres på mindre enn 4 timer uten involvering av komplekse biokjemiske teknikker. I tillegg beskriver vi en normalisering metode som er nødvendig for å få reproduserbar data. De enkle prosedyren og normalisering metodene presentert tillater gjentatte prøvetaking fra samme pasient og generasjon av reproduserbar data som kan sammenlignes med mellom tidspunkt å vurdere potensielle behandling effekter.
Trøtthet er en utbredt og sørgelig tilstand som har en negativ innvirkning på livskvaliteten kreft pasienter1. Til denne datoen, kreft trøtthet er fortsatt dårlig definert og bare avhengig av subjektive rapportering av pasienter2. Derfor er det et presserende behov for å identifisere en enkelt tilpasses diagnostisk laboratorietest objektivt betegner tretthet i klinisk setting3,4.
Flere underliggende mekanismer, inkludert mitokondriene dysfunksjon, foreslått å forårsake tretthet5. Mitokondrier er drivkraft organeller, gir 95% av mobilnettet energibehov via oxidative fosforylering, og spiller en viktig rolle i kalsium signalering, apoptose, immun signalering og regulering av andre intracellulær signalnettverk hendelser6 . Følgelig kan svekket mitokondrie bioenergi og defekter i energiproduksjon bidra til trøtthet. Støtter denne hypotesen, har tidligere studier observert mutasjoner i Mitokondrielt DNA hos pasienter med kronisk fatigue syndrome7. Mens det er uklart om patofysiologiske opprinnelsen til trøtthet ligger i sentralnervesystemet eller perifere vev, for eksempel skjelettmuskulatur8,9, finnes det for øyeblikket ingen direkte måte å vurdere nøyaktig Mitokondrielt dysfunksjon knyttet til trøtthet i live, respiring celler.
Hvis du bruker perifert blod mononukleære celler (PBMCs) for å studere mitokondrie funksjonen har flere fordeler. Først PBMCs er lett tilgjengelig i klinisk setting med standard phlebotomy og kan isoleres raskt ved hjelp av grunnleggende laboratorium teknikker. Andre er blod samling mindre invasiv enn å samle andre vev som en muskel biopsi. Dermed kan blodprøver hentes fra samme pasient gjentatte ganger over tid, som muliggjør langsgående vurdering av behandling effekter. Interessant, syntes mitokondrie funksjon i PBMCs å være godt korrelert med nyre mitokondrie status i en dyremodell10. Videre har immun cellen mitokondrier blitt brukt som en proxy for å oppdage systemisk endringer under forskjellige sykdom forhold11,12. Mitokondrier i sirkulerende immunceller er spesielt følsomme for endringer i immunforsvaret funksjoner og immun signalnettverk molekyler som cytokiner13,14,15. Det er for eksempel observert at PBMCs fra pasienter med akutt revmatiske inflammatoriske sykdommer ha høy planlagte oksygen forbruk14. Derimot ble oksygenforbruk redusert i PBMCs isolert fra pasienter med systemiske opphissende vilkårene inkluderer sepsis16. Under inflammatoriske tilstander, kan frie radikaler produseres av dysfunksjonelle mitokondriene ytterligere bidra til forhøyet oksidativt stress og langvarig betennelse17. Sentral rolle i mitokondrier i energiproduksjon og som oksidativt stress foreslår mulige nytten av funksjonen mitokondrie som en proxy for å studere tretthet i kreft pasienter 13.
Tidligere studier undersøke mitokondrie funksjonen benyttes biokjemiske teknikker, mitokondrie membran potensielle mål eller isolering av bestemt celle populasjoner som ikke kan være lett tilpasses i klinisk setting5, 14,18. De siste årene, utviklingen av ekstracellulære flux analyser har tillatt forskere til å enkelt og undersøke nøyaktig endringer i oksygen forbruksraten (OCR) svar på automatiserte injeksjoner av respiratoriske hemmere19,20 , 21 , 22. men de fleste av disse studiene er utformet for bestemte celletyper og store høy gjennomstrømming format kanskje ikke være tilgjengelig i en klinisk setting. I dette manuskriptet beskrive vi en optimalisert protokoll for å undersøke mitokondrie funksjon for klinisk bruk.
Trøtthet i kreftpasienter er en ødeleggende tilstand som ikke godt definert eller preget1. Diagnostisering av trøtthet er helt avhengig av subjektive rapportering og det er ingen gjeldende diagnostiske standarden eller behandling for denne tilstanden, hovedsakelig på grunn av mangel på forståelse i det pathobiology2. Av foreslåtte mekanismene bak trøtthet i kreftpasienter, er verdifall i mitokondrie funksjon en av de mest terapeutisk targetable. Derfor utviklet vi e…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien er fullt støttet av delingen av Intramural forskning av National Institute for sykepleie forskning NIH, Bethesda, Maryland.
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |