Vårt mål var att utveckla en praktisk protokoll för att utvärdera mitokondriell dysfunktion är associerad med trötthet hos patienter med cancer. Detta innovativa protokoll är optimerad för klinisk användning involverar endast standard flebotomi och grundläggande laboratorierutiner.
Trötthet är ett vanligt och handikappande tillstånd som drabbar de flesta cancerpatienter. Hittills, test trötthet förblir dåligt kännetecknas med inga diagnostiska för att objektivt mäta svårighetsgraden av detta tillstånd. Här beskriver vi en optimerad metod för att bedöma mitokondriefunktion av PBMC samlas in från trött cancerpatienter. Använda en kompakt extracellulära flux system och sekventiell insprutning av respiratoriska hämmare, granskat vi PBMC mitokondriell funktionella status genom mätning av basal mitokondriell respiration, respiratorisk reservkapacitet och energi fenotyp, som beskriver den Rekommenderad energi väg att reagera på stress. Färsk PBMC är lätt tillgängliga i den kliniska inställningen använder standard flebotomi. Hela analysen beskrivs i detta protokoll kan utföras i mindre än 4 timmar utan inblandning av komplexa biokemiska tekniker. Dessutom beskriver vi en normalisering-metod som är nödvändiga för att erhålla reproducerbara data. De enkla förfarandet och normalisering metoder presenteras tillåter upprepad provtagning från samma patient och generering av reproducerbara data som kan jämföras mellan tidpunkter att utvärdera potentiella behandlingseffekter.
Trötthet är ett utbrett och smärtsamt tillstånd som har en negativ inverkan på livskvaliteten av cancer patienter1. Till detta datum, cancer trötthet är fortfarande dåligt definierade och bygger endast på subjektiv rapportering av patienter2. Därför finns det ett brådskande behov av att identifiera en lätt anpassningsbar diagnostiska laboratorietest för att objektivt karakterisera trötthet i klinisk miljö3,4.
Flera underliggande mekanismer, inklusive mitokondrier dysfunktion, har föreslagits att orsaka trötthet5. Mitokondrier är kraftpaket organeller, som ger 95% av cellulära energibehov via oxidativ fosforylering, och spelar en viktig roll i Kalciumsignalering, apoptos, immun signalering och reglering av andra Intracellulär signalering händelser6 . Nedsatt mitokondriell Bioenergetik och defekter i energiproduktionen kan följaktligen bidra till trötthet. Stöder denna hypotes, har tidigare studier observerat mutationer i mitokondrie-DNA hos patienter med kronisk trötthet syndrom7. Medan det är oklart huruvida patofysiologiska beskärningen av trötthet ligger inom centrala nervsystemet eller perifera vävnader, såsom muskler8,9, finns det för närvarande ingen direkt metod att korrekt bedöma mitokondriell dysfunktion relaterade till trötthet i live, respiring celler.
Med perifera mononukleära blodceller (PBMC) för att studera mitokondriefunktion erbjuder flera fördelar. Först PBMC är lätt tillgängliga i den kliniska inställningen använder standard flebotomi och kan isoleras snabbt med hjälp av grundläggande laboratorietekniker. Andra är blodinsamling mindre invasiv än att samla andra vävnader såsom en muskelbiopsi. Således, blodprov kan tas från samma patient upprepade gånger över tid, vilket underlättar längsgående utvärdering av behandlingseffekter. Intressant, föreföll mitokondriell funktion i PBMC vara väl korrelerad med njure mitokondriell status i en djurmodell10. Dessutom har immunceller mitokondrierna använts som en proxy för att upptäcka systematiska förändringar under olika sjukdomen villkor11,12. Mitokondrierna i cirkulerande immunceller är särskilt känslig för förändringar i immunförsvaret och immun signalmolekyler som cytokiner13,14,15. Exempelvis har det observerats att PBMC från patienter med akuta reumatiska inflammatoriska sjukdomar uppvisar hög baslinjen syre förbrukning14. Däremot minskade syreförbrukningen i PBMC isolerade från patienter med systemiska inflammatoriska tillstånd inklusive sepsis16. Under inflammatoriska tillstånd, kan fria radikaler produceras av dysfunktionella mitokondrier ytterligare bidra till förhöjda oxidativ stress och långvarig inflammation17. Centralrollen av mitokondrier i energiproduktion samt liksom oxidativ stress tyder på potentiella nyttan av att använda mitokondriefunktion som en proxy för att studera trötthet i cancer patienter 13.
Tidigare studier undersöker mitokondriefunktion utnyttjas biokemiska tekniker, mitokondriella membranet potentiella mätning eller isolering av specifika cellpopulationer som inte kanske är lätt anpassningsbar i klinisk miljö5, 14,18. Under senare år har utvecklingen av extracellulära flux analyser har låtit forskare att enkelt och undersöka noggrant förändringar i syre materialåtgången (OCR) som svar på automatiserade injektioner av respiratoriska hämmare19,20 , 21 , 22. men de flesta av dessa studier är utformade för specifika celltyper och formatet stor hög genomströmning kan inte tillämpas i en klinisk miljö. I detta manuskript beskriver vi ett optimerat protokoll för att pröva mitokondriefunktion för klinisk användning.
Trötthet hos cancerpatienter är ett handikappande tillstånd som inte är väl definierad eller kännetecknas1. Diagnos av trötthet bygger helt på subjektiva rapportering och det finns ingen aktuell diagnostiskt standard eller behandling för detta tillstånd, till stor del på grund av bristande förståelse i sin patobiologi2. Av de föreslagna mekanismerna bakom trötthet hos patienter med cancer, är nedskrivningar i mitokondriefunktion en av de mest terapeutiskt ta…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöds fullt ut av avdelningen för intern forskning av nationella institutet för omvårdnad forskning av NIH, Bethesda, Maryland.
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |