Production de protéine élastine Hydrogels pour Encapsulation et immunomarquage des cellules en 3D
Summary
Hydrogels d’ingénierie de protéines recombinantes sont avantageuses pour la culture cellulaire 3D car ils permettent accordabilité complète de l’épine dorsale de polymère et par conséquent, le microenvironnement cellulaire. Nous décrivons ici le processus de purification de protéine recombinante élastine et son application dans l’encapsulation de cellules 3D hydrogel.
Abstract
Deux dimensions (2D) culture de tissus techniques ont été essentiels pour notre compréhension de la biologie cellulaire fondamentale. Toutefois, le manque de systèmes de culture de tissu 2D traditionnelle une matrice tridimensionnelle (3D), ce qui entraîne un important manque de concordance entre les résultats recueillis in vitro et in vivo. Pour combler cette lacune, les chercheurs ont conçu plates-formes de vitroplants hydrogel 3D qui peuvent imiter les propriétés biochimiques et biophysiques du microenvironnement cellulaire in vivo . Cette recherche a motivé la nécessité de développer des plates-formes matérielles qui prennent en charge l’encapsulation de cellules 3D et des épreuves biochimiques en aval. Ingénierie des protéines recombinantes propose un ensemble d’outils unique pour hydrogel 3D conception matérielle et le développement en permettant le contrôle spécifique de la séquence des protéines et donc, par extension, les propriétés mécaniques et biochimiques potentielles de la résultante matrice. Nous présentons ici un protocole pour l’expression des protéines sont elastin-like dérivées d’inoculation (PEL), qui peut être utilisé pour les hydrogels de formulaire avec les propriétés mécaniques réglables indépendamment et de la concentration de ligand cellule-adhésif. Plus loin, nous présentons une méthodologie pour l’encapsulation de cellules au sein de l’ELP hydrogels et immunofluorescence ultérieures d’intégrés pour analyse en aval et la quantification des cellules.
Introduction
Depuis un siècle, culture de tissus à deux dimensions (2D) est devenue un ensemble d’outils intégré pour l’étude de biologie cellulaire fondamentale in vitro. En outre, les protocoles relativement simples et peu coûteuse pour la culture cellulaire 2D ont conduit à son adoption à travers de nombreuses disciplines biologiques et médicales. Cependant, recherches antérieures ont montré que des plates-formes 2D traditionnelles peuvent conduire à des résultats que s’écarter sensiblement de ceux collectés in vivo, causant un temps précieux et financement gaspillé pour recherche clinique orientée vers1,2, 3. Nous et autres émis l’hypothèse que cette différence peut être attribuée à l’absence de natives indices biochimiques et biophysiques fournis aux cellules cultivées sur une surface 2D, qui peut s’avérer nécessaire de prolifération optimale et de maturation des différents types de cellules.
Pour remédier à ces limites et aide le pont l’écart entre 2D études in vitro et in vivo , les chercheurs ont développé en trois dimensions hydrogel (3D) plates-formes pour cellule-encapsulation1,4,5 ,6. Les hydrogels sont des matériaux idéaux pour récapituler le microenvironnement endogène de la matrice extracellulaire (ECM) en vivo grâce à leur tissu-comme des propriétés mécaniques et une structure gonflés par l’eau qui permet le transport rapid des éléments nutritifs et signalisation des facteurs7,8. En outre, hydrogels 3D peuvent être conçus pour avoir un contrôle indépendant sur les propriétés mécaniques et biochimiques de l’échafaudage. Tant matrice mécanique9,10,11,12 et des ligands cellulaires-adhésif13,14,15 sont bien connus pour influencer la cellule comportement en vitro et in vivo. Ainsi, les hydrogels 3D avec propriétés accordables offrent une plate-forme afin d’étudier les relations causales entre les cellules et leur microenvironnement. Critères pour une matrice hydrogel 3D idéal comprennent simple, non cytotoxiques cellulaires-encapsulation ainsi accordabilité indépendante des propriétés mécaniques physiologiquement pertinentes et imite de natives cell-adhésif motifs.
Les deux synthétiques (e.g., polyéthylène glycol, acide polylactique, poly (acide glycolique)) et dérivés naturels (p. ex.., alginate, collagène, Matrigel) hydrogels ont des avantages par rapport aux plates-formes de 2D in vitro culture ; Cependant, ils ont aussi des lacunes importantes qui limitent leur applicabilité. Tout d’abord, nombreuses plates-formes dérivés naturels et synthétiques nécessitent des conditions de réticulation sévères qui peuvent être potentiellement toxiques pour les cellules mammifères, conduisant à une diminution de viabilité cellulaire7. En outre, nombreuses plates-formes synthétiques manquent de bioactivité native et doivent être fonctionnalisée par le biais de réactions chimiques secondaires, ce qui peuvent représenter une augmentation des coûts et la complexité16. Enfin, alors que les matériaux dérivés naturels contiennent généralement des domaines de bio-actifs intrinsèques, ils sont souvent en proie à une variabilité élevée à lot et se limitent souvent à former des gels relativement faible7,17.
Ingénierie des protéines recombinantes présente un ensemble unique d’outils pour la conception de matériaux en permettant le contrôle explicite sur la séquence des protéines et, par extension, les propriétés mécaniques et biochimiques potentielles de l’hydrogel final échafaudage18. En outre, en s’appuyant sur les mécanismes biologiques connus d’ Escherichia coli (e. coli) pour exprimer les protéines, matériaux peuvent être produits rentable et cohérente avec la variabilité limitée inter – et intra-lot. La protéine élastine-like (PEL) présentée ici a machiné de trois domaines : (1) une balise T7 et His6 qui permet de marquage fluorescent le tag anticorps, (2) une région « elastin-like » qui confère des propriétés mécaniques élastiques et permet pour produit chimique réticulation et (3) une région de « bio-active » qui code pour des motifs de cellule-adhésif.
Notre région elastin-like est basée sur la séquence canonique d’élastine5 de (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) où quatre de la « Xaa » sites acides aminés sont l’isoleucine (Ile), mais pourraient être conçu pour être n’importe quel acide aminé sauf proline. Cette séquence dote PEL recombinant avec un comportement de température (LCST) critique de la solution plus bas qui peuvent être exploitées pour l’expression après purification simple via thermique vélo19,20. Cette propriété LCST peut être ajustée à thermiquement agrégées à des températures différentes en modifiant les commentaires « Xaa » résidu21,22.
Ici, la position de « Xaa » sur l’un des cinq séquences répétées elastin-like a été remplacée avec le présentatrices d’amine lysine (Lys) l’acide aminé, qui est utilisé pour la réticulation de l’hydrogel. Nos travaux antérieurs ont montré non cytotoxique et robuste de réticulation par réaction avec les réactifs amine RETICULATION tétrakis (hydroxyméthyl) phosphonium chlorure (THPC)23. Par différentes protéines contenu et RETICULATION concentration globale, nous sommes en mesure de produire hydrogels qui peuvent être réglés pour couvrir une rigidité physiologiquement pertinents rang (~0.5-50 kPa)9,23,24. En plus de la mise au point des propriétés mécaniques, adhésion cellulaire au sein de l’hydrogel résulte de l’intégration des domaines de cellule-adhésif canoniques au sein de l’épine dorsale de la protéine de PEL. Par exemple, l’incorporation de la séquence d’acides aminés « RGDS » étendue dérivé de la fibronectine permet adhésion cellulaire et flexibilité conformationnelle, tandis que le brouillés, variante « DGR » compromettante limite d’adhérence cellule-matrice24. En modulant le rapport entre la cellule-adhésif non-adhésifs protéines ainsi que la concentration de protéine totale, nous sommes en mesure de produire efficacement des hydrogels qui couvrent une large gamme de concentration de ligand. Comme résultat, nous avons développé une plateforme hydrogel avec des propriétés biochimiques et biophysiques découplées, qui peuvent être réglées indépendamment pour la culture 3D optimale de divers types de cellules.
En plus de la matrice raideur et accordabilité ligand adhésif, hydrogels recombinants offre la possibilité aux profils de conception de dégradation du matériel spécifique, qui est nécessaire pour la propagation de cellules, prolifération et la migration dans un contexte 3D4 , 9. cette dégradation est offerte par sécrétion cellulaire des protéases qui ciblent spécifiquement l’étendue « RGDS »9 ou élastine comme séquence25. Les hydrogels PEL ont également montrés pour soutenir les épreuves biochimiques suivantes qui sont nécessaires pour étudier la viabilité cellulaire et fonction y compris immunocytochimie comme extraction d’ADN/ARN/protéines pour reverse quantitative transcription-polymérase (qRT-PCR) et Western blot9. Variantes de PEL ont également été utilisés dans un certain nombre de modèles de in vivo et sont connus pour être bien toléré par le système immunitaire26.
Pris ensemble, PEL comme une plate-forme matérielle pour les études de la cellule-encapsulation dispose d’une grande variété d’avantages par rapport aux plates-formes matérielles synthétiques ou d’origine naturelle, qui n’ont souvent pas le même degré d’accordabilité biochimique et biophysique et reproductibilité. En outre, de l’ELP utilisation simple et non cytotoxiques avec une grande variété de types de cellules (par exemple., poussin racine dorsale ganglions14,24, murin progénitrices neurales cellules9,27, bovine des cellules souches mésenchymateuses humaines chondrocytes néonatale28, homme endothélial cellules29,30) permet pour un modèle plus physiologiquement pertinent de l’ECM 3D endogène par rapport à la culture cellulaire 2D. Ici, nous présentons un protocole pour l’expression de la dérivée d’inoculation, encapsulation de cellules de Portfolios pour l’utilisation comme plate-forme hydrogel accordable pour la 3D. Nous présentons également la méthode de marquage fluorescent en aval et microscopie confocale des cellules encapsulées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Purification et expression de protéine recombinante est un outil puissant pour synthétiser des biomatériaux avec une reproductibilité élevée. Dus en grande partie à l’avènement de clonage moléculaire commercialisé, plasmides recombinants personnalisés peuvent être achetés auprès de plusieurs fournisseurs, qui réduit considérablement le temps de travailler avec des matériaux tels que portfolios. De même, plasmides peuvent être demandés directement auprès du laboratoire d’origine lorsque le œuvre …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient T. Palmer et H. Babu (Stanford neurochirurgie) pour la fourniture de murin PNJs. vecteur de l’art à la Figure 4 a été utilisé et adapté de Servier Medical Art sous Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Partie de ce travail a été effectué à la Stanford Nano partagé des installations (FNS), soutenu par la National Science Foundation sous prix ECCS-1542152. N.A.S. reconnaît le soutien de la National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. reconnaît le soutien d’un NRSA NIH bourse pré-doctorale (F31 EB020502) et le programme des boursiers Siebel. S.C.H. reconnaît le soutien de la National Institutes of Health (U19 AI116484 et R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) et le California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Cette recherche a reçu un financement de l’Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), qui est soutenu par le Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et Human Development (NICHD), Institut National de la Troubles neurologiques et course (NINDS) et National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) des instituts nationaux de la santé en vertu de la sentence P2CHD086843 numéro. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues de la National Institutes of Health.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
Riferimenti
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