Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D
Summary
Rekombinantes Protein-Engineering Hydrogele sind für 3D Zellkultur von Vorteil, da sie für komplette Einstellbarkeit der Polymer-Rückgrat und sich somit die Zelle Mikroumgebung ermöglichen. Hier beschreiben wir den Prozess der rekombinante Elastin-wie Proteinreinigung und ihre Anwendung in 3D Hydrogel Zelle Kapselung.
Abstract
Zweidimensionale (2D) Gewebekultur Techniken sind wichtig für unser Verständnis der grundlegenden Zelle Biologie gewesen. Jedoch sammelte traditionelle 2D Gewebekultur Systeme fehlen eine dreidimensionale (3D) Matrix, wodurch eine deutliche Trennung zwischen Ergebnisse in Vitro und in Vivo. Um diese Einschränkung zu beheben, haben Forscher 3D Hydrogel Gewebekultur Plattformen entwickelt, die die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften der in Vivo Zelle Mikroumgebung nachahmen kann. Diese Forschung hat die Notwendigkeit, Material Plattformen entwickeln, die 3D Zelle Kapselung und nachgelagerten biochemischen Assays unterstützen motiviert. Rekombinantes Protein-Engineering bietet eine einzigartige Toolset für 3D Hydrogel-Material-Design und Entwicklung, indem Sie für die spezifische Steuerung der Proteinreihenfolge und daher, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der resultierenden Matrix. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Expression von rekombinant abgeleitet Elastin-Like Protein (ELP), die Form Hydrogele mit unabhängig einstellbaren mechanischen Eigenschaften und Zelle-Klebstoff-Liganden-Konzentration genutzt werden können. Weiter präsentieren wir eine Methodik für die Zelle Kapselung in ELP Hydrogele und anschließende immunofluorescent Färbung der Zellen für nachgelagerte Analyse und Quantifizierung eingebettet.
Introduction
Im vergangenen Jahrhundert entwickelte zweidimensionale (2D) Gewebekultur zu einer integralen Toolset für die grundlegende Zelle Biologie in-vitro-Untersuchung. Darüber hinaus haben die relativ kostengünstige und einfache Protokolle für 2D Zellkultur zu ihrem Erlass in vielen biologischen und medizinischen Disziplinen geführt. Jedoch hat Forschung gezeigt, dass traditionelle 2D Plattformen zu Ergebnissen führen können, dass deutlich von diesen gesammelten in Vivoabweichen, wodurch wertvolle Zeit und Mittel für klinisch orientierte Forschung1,2verschwendet, 3. Wir und andere stellen die Hypothese auf, dass diese Diskrepanz zugeschrieben werden kann, auf den Mangel an einheimischen biochemischen und biophysikalischen Hinweise bereitgestellt, um die Zellen kultiviert auf 2D Oberflächen, die für optimale Vermehrung und Reifung der verschiedenen Zelltypen erforderlich sein können.
Um diese Einschränkungen und Hilfe Brücke die Lücke zwischen 2D anzugehen haben in Vitro und in Vivo Studien, Forscher entwickelten dreidimensionalen (3D) Hydrogel Plattformen für Zelle-Kapselung1,4,5 ,6. Hydrogele sind ideale Materialien zu rekapitulieren die endogenen Mikroumgebung von der extrazellulären Matrix (ECM) in Vivo aufgrund ihrer Gewebe-ähnliche mechanische Eigenschaften und Wasser geschwollen Struktur, schnellen Transport von Nährstoffen und Signalisierung Faktoren7,8. Darüber hinaus können 3D Hydrogele sollen unabhängige Kontrolle der mechanischen und biochemischen Eigenschaften des Gerüstes zu haben. Matrix Mechanik9,10,11,12 und Zelle-Klebstoff Liganden13,14,15 sind bekannte Zelle beeinflussen Verhalten in Vitro und in-vivo. So bieten 3D Hydrogele mit einstellbaren Eigenschaften eine Plattform, um kausale Zusammenhänge zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung zu studieren. Kriterien für eine ideale 3D hydrogelmatrix sind einfache, nicht-zytotoxische Zelle-Kapselung sowie unabhängige Einstellbarkeit der physiologisch relevanten mechanischen Eigenschaften und Mimik native Zelle-Klebstoff-Motive.
Beide synthetischen (zB., Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Poly (glykolische Säure)) und natürlich gewonnen (zB., Alginat, Kollagen, Matrigel) Hydrogele haben Vorteile gegenüber 2D in-vitro- Kultur-Plattformen; Sie haben jedoch auch erhebliche Mängel, die ihre Anwendbarkeit zu begrenzen. Erstens viele synthetische und natürlich gewonnenen Plattformen erfordern harte Vernetzung Bedingungen, die für Säugerzellen potenziell giftig sein können, führt zu verringerte Zelle Lebensfähigkeit7. Darüber hinaus viele synthetische Plattformen fehlt native Bioaktivität und müssen durch chemische Nebenreaktionen funktionalisiert werden die erhöhten Kosten und Komplexität16hinzufügen können. Schließlich, während natürlich gewonnenen Materialien in der Regel innere bioaktive Domänen enthalten, sie sind oft durch hohe Variabilität von Charge zu Charge geplagt und beschränken sich oft auf Bildung relativ schwachen Gele7,17.
Rekombinantes Protein-Engineering präsentiert eine einzigartige Toolset für Materialien Design durch explizite Kontrolle über Proteinreihenfolge und, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der endgültige Hydrogel Gerüst18. Darüber hinaus können durch die Nutzung der bekannten biologischen Maschinen von Escherichia coli (E. Coli), Proteine zu äußern, Materialien kostengünstig und konsequent mit begrenzten inter – und Intra-Batch Variabilität produziert werden. Das Elastin-wie Protein (ELP) hier vorgestellten hat drei technische Bereiche: (1) ein T7 und His6 Tag, das ermöglicht eine Kennzeichnung über Gewebekulturen Antikörper markiert, (2) ein “Elastin-Like”-Region, das verleiht elastische mechanische Eigenschaften und chemische ermöglicht Vernetzung, und (3) eine “Bio-aktiv”-Region, die für Zelle-Klebstoff Motive kodiert.
Elastin-ähnliche Region basiert auf der kanonischen (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 Elastin Sequenz, wo vier ‘Xaa’ Aminosäure-Websites sind Isoleucin (Ile), aber könnte so konzipiert, dass jede Aminosäure außer Prolin. Diese Sequenz stiftet rekombinante ELPs mit untere kritische Temperatur (LCST) lösungsverhalten, die für einfache Reinigung nach dem Ausdruck über thermische Radfahren19,20ausgenutzt werden können. Diese LCST Eigenschaft kann bei unterschiedlichen Temperaturen durch Ändern der Gast ‘Xaa’ Rückstand21,22, thermisch Aggregat abgestimmt werden.
Hier wurde mit Amin-präsentierenden Lysin (Lys) Aminosäure, die “Xaa” Position auf einem der fünf Elastin-artigen Wiederholungen ersetzt, die Hydrogel Vernetzung genutzt wird. Unsere bisherige Arbeit hat nicht zytotoxisch und robuste Vernetzung durch Reaktion mit der Amin-reaktive Vernetzer Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC)23gezeigt. Durch unterschiedliche allgemeine Inhalte und Vernetzer Proteinkonzentration können wir Hydrogele zu produzieren, die optimiert werden können, um eine physiologisch relevanten Steifigkeit Palette (~0.5-50 kPa)9,23,24zu überspannen. Neben der Optimierung der mechanischer Eigenschaften, Zelle Adhäsion innerhalb der Hydrogel-Ergebnisse aus der Integration der kanonischen Zelle-Klebstoff-Domänen innerhalb das Rückgrat des ELP-Proteins. Beispielsweise ermöglicht die Einbeziehung der erweiterten Fibronektin abgeleitet “RGDS” Aminosäure-Sequenz Zelladhäsion und Konformationsänderungen Flexibilität, während das Rührei, unverbindliche “RDGS” Variante schränkt Zellmatrix Haftung24. Durch die Modulation des Verhältnis der Zelle-Klebstoff nichtklebenden Proteine sowie die Gesamt-Protein-Konzentration, können wir effektiv Hydrogele zu produzieren, die eine Vielzahl von Liganden-Konzentration zu überspannen. Resultantly, entwickelten wir eine Hydrogel-Plattform mit entkoppelten biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften, die unabhängig für optimale 3D Culture von verschiedenen Zelltypen abgestimmt werden können.
Neben Matrix Steifigkeit und Klebstoff Liganden Einstellbarkeit bieten rekombinante Hydrogele die Möglichkeit, bestimmte Materialabbau designprofile, die notwendig ist für die Zelle verbreiten, Proliferation und Migration innerhalb einer 3D Rahmen4 , 9. dieser Abbau wird durch Zelle Sekretion von Proteasen, die gezielt die erweiterte “RGDS”9 oder Elastin-Sequenz25gewährt. ELP Hydrogele haben auch gezeigt, dass die nachfolgenden biochemischen Assays zu unterstützen, die notwendig sind für das Studium Zellviabilität und Immunocytochemistry, sowie DNA/RNA/Proteingewinnung für quantitative Reverse-Funktion Transkription-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western blot9. ELP-Varianten wurden auch in einer Reihe von in Vivo Modellen verwendet und sind dafür bekannt, die vom Immunsystem26gut vertragen werden.
Zusammengenommen, ELP als eine wesentliche Plattform für Zelle-Kapselung Studien verfügt über eine Vielzahl von Vorteilen im Vergleich zu synthetischen oder natürlich gewonnenen Material Plattformen, die oft nicht über den gleichen Grad an biochemischen und biophysikalischen Einstellbarkeit und Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ELP einfach und nicht zytotoxischen Einsatz mit einer Vielzahl von Zelltypen (zB., Küken Dorsal Root Ganglien14,24, murine neuronalen Vorläuferzellen Zellen9, menschlichen mesenchymalen Stammzellen27, bovine neonatale Chondrozyten28, Human endothelial Zellen29,30) ermöglicht eine mehr physiologisch relevanten Modell des endogenen 3D ECM im Vergleich zu 2D Zellkultur. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den Ausdruck von rekombinant abgeleitet, ELPs für den Einsatz als Durchstimmbare Hydrogel Plattform für 3D Handy Kapselung. Weiter stellen wir die Methodik für die Downstream-fluoreszierende Kennzeichnung und konfokalen Mikroskopie von verkapselten Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinante Proteinexpression und Reinigung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Biomaterialien mit hoher Reproduzierbarkeit zu synthetisieren. Aufgrund weitgehend das Aufkommen der kommerzialisierten molekularen Klonen, können benutzerdefinierte rekombinante Plasmide von mehreren Lieferanten gekauft werden die reduziert die Zeit zum Arbeiten mit Materialien wie ELPs. In ähnlicher Weise können Plasmide direkt aus dem ursprünglichen Labor angefordert werden, wenn das ursprüngliche Werk durch einen Bundesvertrag unter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken T. Palmer und H. Babu (Stanford Neurochirurgie) für die Bereitstellung von murinen NPCs. Vektorgrafiken in Abbildung 4 wurde eingesetzt und angepasst von Servier Medical Art unter Creative Commons Attribution 3.0 Unported Lizenz (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Teil dieser Arbeit wurde an der Stanford Nano geteilt Einrichtungen (SNF), unterstützt von der National Science Foundation unter Award ECCS-1542152 durchgeführt. N.A.S erkennt Unterstützung aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. würdigt Unterstützung durch ein NIH NRSA Pre Promotionsstipendium (F31 EB020502) und Siebel Scholars Program. S.C.H. räumt Unterstützung von den National Institutes of Health (U19-AI116484 und R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006) und am California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Diese Forschung finanziell unterstützt von der Allianz für Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), die von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und menschlichen Entwicklung (NICHD), National Institute of unterstützt wird Neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) von den National Institutes of Health unter Nummer P2CHD086843 Award. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die Ansichten von den National Institutes of Health.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
Riferimenti
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