הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D
Summary
Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.
Abstract
טכניקות מימדי תרביות רקמה (2D) היה חיוני להבנת ביולוגיה של התא הבסיסי. עם זאת, היעדר מערכות התרבות המסורתית של רקמות 2D מטריצה תלת מימדי (3D), וכתוצאה מכך משמעותי נתק בין תוצאות נאסף במבחנה ו vivo בתוך. כדי לטפל מגבלה זו, החוקרים היה לתכנן פלטפורמות תרביות רקמה הידרוג תלת-ממד שיכולים לחקות את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של microenvironment תא ויוו . מחקר זה הניעה את הצורך לפתח פלטפורמות גשמי התומכים תא 3D כימוס של מבחני הביוכימי במורד הזרם. חלבון רקומביננטי הנדסה מציעה ערכת כלים ייחודיים הידרוג תלת-ממד גשמי עיצוב ופיתוח על-ידי מתן שליטה מסוימת של חלבון רצף ולכן, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני תוצאות מטריקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly אלסטין, כמו חלבון (ELP), אשר יכול לשמש כדי hydrogels טופס עם תכונות מכניות באופן עצמאי tunable וריכוז ליגנד תא-דבק. בהמשך אנו מציגים מתודולוגיה תא אנקפסולציה בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels ומוטבעים מכתים immunofluorescent עוקבות של תאים עבור ניתוח במורד הזרם כמת.
Introduction
במהלך המאה האחרונה, מימדי תרביות רקמה (2D) התפתחה כלים אינטגרלי ללמוד תא יסוד ביולוגיה במבחנה. בנוסף, הפרוטוקולים יחסית נמוכים ופשוטים לקבלת תרבית תאים 2D הובילו האימוץ שלה על פני תחומים רבים ביולוגי ורפואי. עם זאת, מחקרים שנעשו בעבר הראו כי פלטפורמות 2D מסורתי עשוי להוביל לתוצאות כי לסטות בצורה ניכרת האלה שנאספו ויוו, גורם זמן יקר ומימון מבוזבז עבור מחקר קליני מונחה1,2, 3. אנחנו ואחרים משערים כי אי-התאמה זו לייחס חוסר רמזים הביוכימי, biophysical יליד מסופקים על התאים תרבותי על משטחים 2D, אשר יכול להיות הכרחי עבור הפצת אופטימלית, ההבשלה של סוגי תאים שונים.
כדי לטפל אלה גשר מגבלות ולעזור הפער בין 2D מחקרים במבחנה , ויוו , חוקרים יש פלטפורמות מפותחת הידרוג תלת מימדי (3D) התא-כימוס1,4,5 ,6. Hydrogels הם חומרים אידיאלי כדי לסכם את microenvironment אנדוגני של ה מטריצה חוץ-תאית (ECM) ויוו עקב שלהם תכונות מכניות רקמה דמוית ומבנה נפוחות-מים המאפשרת מעבר מהיר של חומרים מזינים, איתות גורמים7,8. יתר על כן, 3D hydrogels ניתן לעצב יש שליטה עצמאית על מאפייני מכני וביוכימי לגרדום. מטריקס מכניקה9,10,11,12 והן תא-דבק ליגנדים13,14,15 ידועים להשפיע על התא התנהגות במבחנה , ויוו. לפיכך, hydrogels 3D עם מאפיינים tunable מציעים פלטפורמה כדי לחקור את היחסים סיבתי בין תאים microenvironment שלהם. קריטריונים עבור מטריצה הידרוג 3D אידיאלי כוללים תא פשוט, שאינו-ציטוטוקסיות-כימוס, כמו גם tunability עצמאית של תכונות מכניות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מחקה של מוטיבים תא-דבק מקורית.
שניהם סינתטיים (למשל., פוליאתילן גליקול, חומצה polylactic, פוליפוני (חומצה גליקולית)), נגזר באופן טבעי (למשל., alginate, קולגן, Matrigel) hydrogels יש יתרונות על פני 2D in vitro לקשרי תרבות פלטפורמות; עם זאת, יש להם גם חסרונות משמעותיים אשר להגביל את התחולה שלהם. הראשון, פלטפורמות רבות סינטתיים, נגזר באופן טבעי לדרוש תנאים קשים crosslinking יכול להיות רעיל לתאים בתרבית של, מה שהוביל ירדה תא הכדאיות7. בנוסף, פלטפורמות סינתטיים רבים חוסר אתריים מקורית ויש צורך להיות functionalized דרך משני תגובות כימיות, אשר יכול להוסיף את העלות והמורכבות מוגברת16. לבסוף, בעוד חומרים באופן טבעי-derived מכילים בדרך כלל מהותי בתחומים ביו-אקטיביות, הם לעיתים קרובות מוטרדים על ידי השתנות אצווה-כדי-אצווה גבוהה, לעיתים קרובות מוגבלות ויוצרים ג’לים חלשה יחסית7,17.
חלבון רקומביננטי הנדסה מציג ערכת כלים ייחודיים לעיצוב חומרים על-ידי מתן שליטה מפורשת על חלבון רצף, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני הידרוג הסופי לגרדום18. בנוסף, באמצעות מינוף המנגנון הביולוגי הידוע של Escherichia coli (e. coli) לבטא חלבונים, חומרים יכול להיות מיוצר באופן חסכוני ועקבי עם השתנות מוגבל אינטר – ו אינטרה-אצווה. החלבון כמו אלסטין (ELP) המוצג כאן יש שלושה תחומים מהונדסים: (1) T7 ו His6 תג מאפשר תיוג ויה fluorescently מתויג נוגדנים, (2) אזור ‘אלסטין דמוי’ מקנה תכונות מכניות אלסטית ומאפשרת עבור חומר כימי crosslinking, ו- (3) אזור ‘ביו-אקטיבי’ מקודד עבור התא-דבק מוטיבים.
באזורנו אלסטין דמוי מבוסס על רצף הקנוני של אלסטין5 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) שבו ארבעה מתוך ‘Xaa’ חומצת אמינו באתרים איזולאוצין (Ile), אבל יכול להיות מתוכנן להיות כל חומצה אמינית פרט פרולין. רצף זה מעניק ELPs רקומביננטי עם התחתון התנהגות טמפרטורה (LCST) פתרון קריטי שעלולים להיות מנוצלים לרעה לביטוי שלאחר טיהור פשוטה באמצעות תרמית רכיבה על אופניים19,20. בית מלון LCST זה ניתן לכוונן אותו תרמית צבירה בטמפרטורות שונות על-ידי שינוי של חוות ‘Xaa’ שאריות21,22.
כאן, עמדה ‘Xaa’ על אחד חוזר כמו אלסטין חמש הוחלף את הצגת amine ליזין (Lys) חומצת אמינו, אשר מנוצל עבור הידרוג crosslinking. העבודות הקודמות שלנו הראו crosslinking הלא-ציטוטוקסיות וחזק באמצעות תגובה עם כלוריד (THPC)23phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) crosslinker אמין-ריאקטיבי. מאת בדרגות שונות הכוללת חלבון התוכן crosslinker ריכוז, אנו מסוגלים לייצר hydrogels זה ניתן לכוונן אותו span של נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית טווח (~0.5-50 kPa)9,23,24. בנוסף כוונון תכונות מכניות, התא אדהזיה בתוצאות הידרוג מן השילוב של תחומים תא-דבק קאנונית בתוך עמוד השדרה של החלבון אמרסון, לייק ופאלמר. לדוגמה, שילוב של מורחבים נגזר fibronectin ‘RGDS’ חומצת אמינו הרצף מאפשר תא הידבקות וגמישות הסתגלותי, ואילו מקושקשות, מחייב ‘RDGS’ משתנה מגבילה את תא-מטריקס אדהזיה24. מאת להתכוונן על היחס של התא-דבק חלבונים ללא דבק, כמו גם ריכוז החלבון הכולל, אנו מסוגלים לייצר ביעילות hydrogels שיימתחו מגוון רחב של ליגנד ריכוז. . Resultantly, פיתחנו פלטפורמה הידרוג עם decoupled נכסים הביוכימי, biophysical, אשר ניתן לכוונן באופן עצמאי לתרבות 3D אופטימלית של סוגי תאים שונים.
בנוסף נוקשות מטריקס וליגנד דבק tunability, hydrogels רקומביננטי מציעים את היכולת פרופילים ספציפיים השפלה גשמי עיצוב, אשר הכרחי תא התפשטות, התפשטות של הגירה בתוך ההקשר 3D4 , 9. את ההשפלה הזו המוענקת על ידי הפרשת תא פרוטאזות שמתמקדים ‘RGDS’ מורחבת9 או רצף אלסטין דמוי25. אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels יש גם הוכח כדי לתמוך את מבחני הביוכימי עוקבות הדרושים ללימוד תא הכדאיות ותפקוד כולל immunocytochemistry, כמו גם מיצוי DNA/RNA/חלבון עבור הפוכה כמותיים תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) והמערבית כתם9. אמרסון, לייק ופאלמר משתנים גם השתמשו במספר דגמים ויוו , ידועים להיות נסבל היטב על ידי המערכת החיסונית26.
יחדיו, אמרסון, לייק ופאלמר כמו פלטפורמה גשמי ללימודי תא-כימוס מציע מגוון רחב של יתרונות בהשוואה פלטפורמות חומרים סינתטיים או נגזר באופן טבעי, אשר לעתים קרובות חוסר באותה מידה של tunability הביוכימי, הביו-פיסיקלי ו הפארמצבטית. בנוסף, פשוטה-ציטוטוקסיות לשימוש של אמרסון, לייק ופאלמר עם מגוון רחב של סוגי תאים (למשל., צ’יק העזוב שורש הגרעינים14,24, מאתר קדמון עצבית תאים9,27, שור תאי גזע אנושי mesenchymal neonatal chondrocytes28, האדם אנדותל תאים29,30) מאפשר מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית של ECM 3D אנדוגני בהשוואה תרבית תאים 2D. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly, ELPs לשימוש כפלטפורמה הידרוג tunable 3D תא אנקפסולציה. בהמשך נציג את המתודולוגיה תיוג פלורסנט למטה-stream, מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים שעברו אנקפסולציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביטוי חלבון רקומביננטי טיהור הוא כלי רב עוצמה כדי לסנתז biomaterials עם הפארמצבטית גבוהה. בעיקר בשל כניסתו של שיבוט מולקולרי ממוסחר, פלסמידים רקומביננטי מותאם אישית ניתן לרכוש מהספקים מספר, אשר מפחית באופן משמעותי את הזמן כדי לעבוד עם חומרים כמו ELPs. באופן דומה, ניתן לבקש פלסמידים ישירות מן המעב?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה פאלמר, ה באבו (סטנפורד נוירוכירורגיה) למתן מאתר באמנות NPCs. וקטור באיור 4 בשימוש ומותאמים מאמנות רפואי שרת תחת יצירתי של מלאי ייחוס 3.0 רישיון (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). חלק מעבודה זו בוצעה ב סטנפורד ננו משותפים מתקנים (SNSF), הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מרכזים לגיל הרך-1542152. N.A.S. מאשר תמיכה מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים (32GM 008412). ובין מאשר תמיכה של NRSA NIH מראש דוקטורט (F31 EB020502), חוקרים לגשת לתוכנית של Siebel. S.C.H. מאשר תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (U19 AI116484 ו- R21 EB018407), הקרן הלאומית למדע (DMR 1508006), מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (RT3-07948). מחקר זה קיבל מימון הברית עבור הדרכה (AR3T), ומחקר השיקום רגנרטיבית נתמך על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות והתפתחות האדם (NICHD), המכון הלאומי הפרעות נוירולוגיות שבץ (NINDS) ו המכון הלאומי של הדמיה ביו, בביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת P2CHD086843 מספר פרס. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
Riferimenti
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
- Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
- Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
- Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
- Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
- Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
- McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
- McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
- Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
- Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
- Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
- Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
- Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
- Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
- Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
- Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).
