Produksjonen av Elastin som Protein Hydrogels for innkapsling og immunostai-celler i 3D
Summary
Rekombinant protein-konstruert hydrogels er fordelaktig for 3D cellekultur for fullstendig tunability av polymer ryggraden og derfor celle microenvironment. Her beskriver vi rekombinant elastin som protein rense og dens anvendelse i 3D hydrogel celle innkapsling.
Abstract
Todimensjonal (2D) vev kultur teknikker har vært viktig for vår forståelse av grunnleggende cellebiologi. Men samlet tradisjonelle 2D vev kultur systemer mangel en tredimensjonal (3D) matrise, noe som resulterer i en betydelig koble mellom resultater i vitro og i vivo. For å løse denne begrensningen, har forskere konstruert 3D hydrogel vev kultur plattformer som kan etterligne egenskapene biokjemiske og Biofysiske i vivo celle microenvironment. Denne forskningen har motivert måtte utvikle materiale plattformer som støtter 3D-cellen innkapsling og nedstrøms biokjemiske analyser. Rekombinant protein engineering tilbyr et unikt verktøysett for 3D hydrogel materielt design og utvikling ved at for bestemte kontrollen av protein og derfor potensielle mekaniske og biokjemiske egenskaper for resulterende matrise. Her presenterer vi en protokoll for uttrykk for recombinantly-avledet elastin som protein (ELP), som kan brukes til skjemaet hydrogels med uavhengig tunable mekaniske egenskaper og celle-klebende ligand konsentrasjon. Presenterer vi ytterligere en metodikk for cellen innkapsling innen ELP hydrogels og senere immunofluorescent farging av innebygde celler for nedstrøms og kvantifisering.
Introduction
Over det siste århundret, har todimensjonal (2D) vev kultur utviklet seg til et integrert verktøysett for å studere grunnleggende celle biologi i vitro. I tillegg har relativt lave kostnader og enkel protokollene for 2D cellekultur ført til innføringen på tvers av mange biologisk og medisinsk disipliner. Men har tidligere forskning vist at tradisjonelle 2D plattformer kan føre til resultater som avviker markant fra de samlet i vivo, forårsaker dyrebare tid og finansiering bortkastet for klinisk orientert forskning1,2, 3. Vi og andre hypothesize at dette avviket kan tilskrives mangel på innfødt biokjemiske og Biofysiske signaler gitt til cellene kultivert på 2D overflater, som kan være nødvendig for optimal spredning og modning av ulike celletyper.
For å løse disse begrensninger og hjelpe broen gapet mellom 2D har i vitro og vivo studier, forskere utviklet tredimensjonale (3D) hydrogel plattformer for celle-innkapsling1,4,5 ,6. Hydrogels er ideelle materialer til recapitulate endogene microenvironment av ekstracellulær matrix (EFM) i vivo deres vev som mekaniske egenskaper og vann-hovne struktur som muliggjør rask transport av næringsstoffer og signalisering faktorer7,8. Videre kan 3D hydrogels utformes uavhengig kontroll over mekaniske og biokjemiske egenskaper av stillaset. Både matrise, mekanikere,9,,10,,11,,12 og celle-klebende ligander13,14,15 er godt kjent for å påvirke celle virkemåten i vitro og i vivo. Dermed tilbyr 3D hydrogels med tunable egenskaper en plattform for å studere årsaksforhold mellom celler og deres microenvironment. Kriteriene for en ideell 3D hydrogel matrise er enkel, non-cytotoksiske celle-innkapsling samt uavhengige tunability av fysiologisk relevante mekaniske egenskaper og forfalsker av innfødte celle-klebende motiver.
Begge syntetisk (f.eks., polyetylenglykol, polylactic syre, poly (glycolic acid)) og naturlig (f.eks., alginate, kollagen, Matrigel) hydrogels har fordeler over 2D i vitro kultur plattformer; men har de også betydelige mangler som begrenser deres anvendbarhet. Først mange syntetiske og naturlig plattformer krever sterke crosslinking forhold som kan være potensielt giftig for pattedyrceller, fører til redusert celle levedyktighet7. I tillegg mange syntetiske plattformer mangler innfødte bioactivity og vil være functionalized gjennom sekundære kjemiske reaksjoner, som kan legge til økte kostnader og kompleksitet16. Til slutt, mens naturlig materialer vanligvis inneholder innebygde bio-aktive domener, de er ofte plaget av høye parti til parti variasjon og er ofte begrenset til danner relativt svake gels7,17.
Rekombinant protein engineering presenterer en unik verktøysett for materialer design gir eksplisitt kontroll over protein sekvens, og dermed potensielle mekaniske og biokjemiske egenskaper for den endelige hydrogel stillas18. I tillegg, ved å utnytte det velkjente biologiske maskineriet av Escherichia coli (E. coli) å uttrykke proteiner, kan materialer produseres kostnadseffektivt og konsekvent med begrenset inter – og intra-batch variasjon. Elastin som protein (ELP) presenteres her har tre utvikling domener: (1) en T7 og His6 kode som tillater merking fluorescently merket antistoffer, (2) en “elastin-like”-regionen som gir elastisk mekaniske egenskaper og gir kjemisk crosslinking, og (3) en ‘bio-aktive’-regionen som koder for celle-klebende motiver.
Vår elastin som region er basert på kanonisk (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sekvensen der fire ‘Xaa’ aminosyre nettsteder isoleucin (Ile), men kan være designet for å være noen aminosyre unntatt proline. Denne sekvensen endows rekombinant ELPs med lavere kritisk løsning temperatur (LCST) atferd som kan utnyttes for enkel rensing etter uttrykket via termisk sykling19,20. Denne LCST-egenskapen kan være innstilt til termisk samlet ved forskjellige temperaturer ved å endre de gjest ‘Xaa’ rester21,22.
Her er ‘Xaa’ posisjon på en av fem elastin-lignende gjentakelser erstattet med Amin-presentere lysin (Lys) aminosyren, som benyttes for hydrogel crosslinking. Våre tidligere arbeid har vist ikke-cytotoksiske og robust crosslinking via reaksjon med Amin-reaktive crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chloride (THPC)23. Av varierende samlede protein innhold og crosslinker konsentrasjon er vi i stand til å produsere hydrogels som kan stilles inn slik at den dekker en fysiologisk relevante stivhet utvalg (~0.5-50 kPa)9,23,24. I tillegg til tuning mekaniske egenskaper, celle vedheft innen hydrogel resultatene av integrering av kanoniske celle-klebende domener i ryggraden i ELP protein. For eksempel inkorporering av den utvidede fibronectin-avledet ‘RGDS’ aminosyresekvens gir celleadhesjon og conformational fleksibilitet, mens den eggerøre, uforpliktende ‘RDGS’ variant begrenser celle matrise vedheft24. Ved modulerende forholdet mellom cellen-klebende ikke selvklebende proteiner som totalt protein konsentrasjonen, er vi kunne effektivt produsere hydrogels som spenner over et bredt spekter av ligand konsentrasjon. Resultantly, har vi utviklet en hydrogel plattform med avparet biokjemiske og Biofysiske egenskaper, som kan være uavhengig innstilt for optimal 3D kultur ulike celletyper.
Matrix stivhet og lim ligand tunability tilbyr rekombinant hydrogels muligheten design bestemt materiale fornedrelse profiler, som er nødvendig for cellen spre, spredning og Flyttinger innenfor en 3D sammenheng4 , 9. denne fornedrelse by av cellen utskillelsen av proteaser som spesifikt mà enten utvidet ‘RGDS’9 eller elastin-lignende sekvens25. ELP hydrogels har også vist seg å støtte de påfølgende biokjemiske analyser som er nødvendige for å studere celle levedyktighet og funksjon inkludert immunocytochemistry samt DNA/RNA/protein utvinning for kvantitative omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR) og Western blot9. ELP varianter har også blitt brukt i en rekke i vivo modeller og er kjent for å være godt tolerert av immunsystemet26.
Tatt sammen ELP som en regning plattform for celle-innkapsling studier har en rekke fordeler sammenlignet med syntetisk eller naturlig materiale plattformer, som ofte mangler den samme graden av biokjemiske og Biofysiske tunability og reproduserbarhet. I tillegg ELPS enkel og ikke-cytotoksiske bruk med en rekke celletyper (f.eks., chick dorsal root Ganglion14,24, murine nevrale celler9, menneskelige mesenchymal stamceller27, storfe neonatal chondrocytes28, menneskelige endothelial cellene29,30) gir en mer fysiologisk relevante modell av endogene 3D ECM forhold til 2D cellekultur. Her presenterer vi en protokoll for uttrykk for recombinantly-avledet, ELPs for bruk som tunable hydrogel plattform for 3D celle innkapsling. Vi presenterer ytterligere metodikken for ned-stream fluorescerende merking og AC confocal mikroskopi innkapslede celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinant protein uttrykk og rensing er et kraftig verktøy for å syntetisere biologisk materiale med høy reproduserbarhet. På grunn hovedsak til bruk av kommersialiserte molekylær kloning, kan egendefinerte rekombinant plasmider kjøpes fra flere leverandører, noe som reduserer tiden til å arbeide med materialer som ELPs. Tilsvarende kan plasmider anmodes direkte fra den opprinnelige lab når den opprinnelige arbeidet ble støttet av en føderal kontrakt og det videre arbeidet vil være for non-profit bruk. Full…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker T. Palmer og H. Babu (Stanford Neurosurgery) for å gi murine NPCer. vektor kunst i Figur 4 ble brukt og tilpasset fra klientforespørslene Medical Art under Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Del av dette arbeidet ble utført på den Stanford Nano delte fasiliteter (SNSF), støttet av National Science Foundation under prisen ECCS-1542152. N.A.S. anerkjenner støtte fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. anerkjenner støtte fra en NIH NRSA pre fellesskap (F31 EB020502) og den Siebel Scholars Program. S.C.H. anerkjenner støtte fra National Institutes of Health (U19 AI116484 og R21 EB018407) og National Science Foundation (DMR 1508006) California Institutt for regenerativ medisin (RT3-07948). Denne forskningen mottatt finansiering fra Alliansen for regenerativ rehabilitering forskning og opplæring (AR3T), som støttes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Nevrologiske lidelser og strek (NINDS) og National Institute of biomedisinsk bildebehandling og bioteknologi (NIBIB) av de nasjonale instituttene for helse under prisen nummer P2CHD086843. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
Riferimenti
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
- Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
- Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
- Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
- Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
- Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
- McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
- McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
- Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
- Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
- Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
- Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
- Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
- Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
- Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
- Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).
