Производство белка эластина как гидрогели для инкапсуляции и иммуноокрашивания клеток в 3D
Summary
Рекомбинантный белок инженерии гидрогели являются выгодными для 3D клеточной культуры, поскольку они позволяют для полной перестройки полимера позвоночника и, следовательно, микроокружения клеток. Здесь мы описываем процесс очистки рекомбинантных белков эластина как и его применение в 3D гидрогеля клеток инкапсуляции.
Abstract
Двухмерный (2D) культуры ткани методы имели важнейшее значение для нашего понимания фундаментальных клеточной биологии. Однако отсутствие систем традиционные 2D культуры ткани, матрицу трехмерного (3D), что привело к значительному разрыв между результаты собраны в пробирке и в естественных условиях. Чтобы устранить это ограничение, исследователи инженерии 3D гидрогеля культуры ткани платформ, которые могут имитировать биофизических и биохимических свойств микроокружения клеток в естественных условиях . Это исследование побудило необходимость разработки материалов платформ, которые поддерживают 3D клеток инкапсуляции и ниже по течению биохимических анализов. Рекомбинантный белок Инжиниринг предлагает уникальный набор инструментов для 3D гидрогеля материал дизайн и развития, позволяя для определенного контроля последовательности белка и, следовательно, выдвижением, потенциальные механических и биохимических свойств результирующей Матрица. Здесь мы представляем протокол для выражения recombinantly производные эластин как белка (ELP), который может использоваться для формы гидрогели самостоятельно перестраиваемый механических свойств и концентрации клеток клей лиганда. Мы далее представить методологию для инкапсуляции ячейки в пределах ELP гидрогелей и последующего immunofluorescent окрашивание встроенных клетки течению анализа и количественной оценки.
Introduction
За последнее столетие двухмерный (2D) тканевой культуры превратился в составной набор инструментов для изучения основных клеток биологии в пробирке. Кроме того относительно недорогих и простых протоколов для 2D клеточной культуры привели к его принятию во многих биологических и медицинских дисциплин. Однако последние исследования показали, что традиционные 2D платформы может привести к результатам, что отклоняться заметно от этих собранных в естественных условиях, вызывая драгоценное время и средства впустую клинически ориентированных исследований1,2, 3. Мы и другие предполагают, что это расхождение может объясняться отсутствием родной биохимические и биофизические подсказки для ячейки, культивируемых на 2D-поверхностей, которые могут быть необходимы для оптимального распространения и созревания различных типов клеток.
Для устранения этих ограничений и помочь мост разрыва между 2D in vitro и in vivo исследования, исследователи имеют развитые трехмерные (3D) гидрогеля платформ для клеток инкапсуляции1,4,5 ,6. Гидрогели являются идеальным материалами для пилки эндогенного микроокружения внеклеточного матрикса (ECM) в естественных условиях из-за их механические свойства ткани, как и вода опухшие структуры, которая позволяет быстрый транспорт питательных веществ и сигнализации факторы7,8. Кроме того 3D гидрогели могут быть разработаны для независимого контроля над механических и биохимических свойств леса. Матрица механика9,10,,1112 и клеток клей лигандов13,,1415 хорошо известны влиять на клетки поведение в пробирке и в vivo. Таким образом 3D гидрогели с перестраиваемой свойства предлагают платформу для изучения причинно-следственных связей между клетками и их микроокружения. Критерии для идеального 3D гидрогеля матрицы включают простой, не цитотоксических клеток инкапсуляции, а также независимые перестройки физиологически соответствующих механических свойств и имитирует родной клеток клей мотивов.
Оба синтетические (например., полиэтиленгликоль, полимолочной кислоты, поли (гликолевая кислота)) и естественно производные (например., альгинат, коллаген, Matrigel) гидрогели имеют преимущества над 2D в vitro культуры платформ; Однако они также имеют существенные недостатки, ограничивающие их применимости. Во-первых, многие синтетические и естественно производные платформ требуют суровых сшивки условий, которые могут быть потенциально токсичными для клеток млекопитающих, ведущих к снижение жизнеспособности клеток7. Кроме того многие синтетические платформ не хватает родной биологическую и нужно быть функционализированных через вторичных химических реакций, которые можно добавить повышение стоимости и сложности16. Наконец в то время как естественно производные материалы обычно содержат встроенные био активных доменов, они часто страдают от высокой изменчивости партии к партии и часто ограничиваются формирования относительно слабый гели7,17.
Рекомбинантный белок инженерии представляет уникальный набор инструментов для дизайна материалов, позволяя явный контроль над последовательности белка и выдвижением, потенциальные механических и биохимических свойств окончательного гидрогеля эшафот18. Кроме того используя известные биологического механизма Escherichia coli (E. coli) выразить белков, могут изготавливаться материалы эффективно и последовательно с ограниченной Интер – и интра Пакетная изменчивости. Эластин подобных белков (ELP) представлены здесь имеет три инженерии доменов: (1 T7 и His6 тег, который позволяет для маркировки через дневно меткой антител, (2 «эластин как» регион, который наделяет упругой механических свойств и позволяет для химического сшивки и (3) «био активных» регион, который кодирует для клеток клей мотивы.
Наш регион эластин как основана на канонической (Валь-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 эластина последовательности, где четыре из Xaa сайты аминокислоты изолейцина (Ile), но может быть разработан, чтобы быть любой аминокислот Кроме пролина. Эта последовательность наделяет рекомбинантных ELPs с нижней температуры (СМЕШЕНИЯ) поведением критические решения, которые могут быть использованы для простой очистки после выражения через тепловые Велоспорт19,20. Это свойство СМЕШЕНИЯ могут быть настроены для термически совокупных при разных температурах, изменяя гость «Xaa» остатков21,22.
Здесь «Xaa» позиции на одном из пяти повторений эластин как была заменена Амин представляя лизина (Lys) аминокислота, которая используется для сшивания гидрогеля. Наши предыдущие работы показал не цитотоксических и надежные сшивки реакции с Амин реактивный сшивателя тетракис (гидроксиметил) фосфониевых хлорид (THPC)23. По различной общее содержание и сшивателя концентрацию белка мы в состоянии производить гидрогели, которые могут быть настроены для диапазона23,9,физиологически соответствующей жесткости диапазона (~0.5-50 кПа)24. Помимо Тюнинг механических свойств, клеточной адгезии в пределах гидрогеля результаты от интеграции канонических клеток клей домены в пределах костяк ELP белка. Например включение расширенной фибронектин производные «RGDS» аминокислотной последовательности позволяет для клеточной адгезии и конформационные гибкость, а омлет, обязательной «RDGS» вариант ограничивает ячейки матрицы адгезии24. Путем модулирования соотношение клеток клей для не клей белков, а также концентрации общего белка, мы способны эффективно производить гидрогели, которые охватывают широкий спектр лигандом концентрации. Resultantly мы разработали платформу гидрогеля с развязкой биохимические и биофизические свойства, которые могут быть настроены независимо для оптимального 3D культуры различных типов клеток.
Помимо матрицы жесткости и клей лигандом перестройки рекомбинантных гидрогели предлагают возможности для разработки конкретных деградации материала профилей, который необходим для распространения клеток, распространением и миграции в рамках 3D контексте4 , 9. Эта деградация обеспечивается клеток секрецию протеаз, которые специально направлены на расширенной «RGDS»9 или эластин как последовательность25. ELP гидрогели, также было показано, для поддержки последующих биохимических анализов, которые необходимы для изучения жизнеспособности клеток и функции, включая immunocytochemistry, а также извлечения ДНК/РНК/белков для количественных реверс транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) и западной помарки9. ELP варианты также были использованы в ряде моделей в естественных условиях и, как известно, быть хорошо переносится иммунной системы26.
Вместе взятые, ELP как материальный платформу для исследования клеток инкапсуляции предлагает широкий спектр преимуществ по сравнению с синтетической или естественно производного материала платформы, которые зачастую не имеют такую же степень биохимические и биофизические перестройки и воспроизводимость. Кроме того, ПЭП простой и не цитотоксических использования с широкий спектр типов клеток (например., куриных Спинной корень ганглиев14,24, мышиных нейронных прародитель клетки9, человека мезенхимальных стволовых клеток27, говяжьи новорожденных хондроцитов28, человека эндотелиальных клеток29,30) позволяет для более физиологически соответствующие модели эндогенного 3D ECM, по сравнению с 2D клеточной культуры. Здесь мы представляем протокол для выражения recombinantly производные, ELPs для использования в качестве платформы перестраиваемый Гидрогель для 3D мобильных инкапсуляции. Далее мы представляем методологии вниз по течению люминесцентные маркировки и confocal микроскопии инкапсулированных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рекомбинантных белков и очистки является мощным инструментом для синтеза биоматериалов с высокой воспроизводимостью. Во многом обусловлено появлением коммерциализированной молекулярное клонирование, пользовательские рекомбинантных плазмид можно приобрести от нескольких поставщ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят т. Палмер и H. Бабу (Stanford нейрохирургия) для предоставления мышиных РНУ. вектор искусства на рисунке 4 был использован и адаптированный Servier медицинского искусства под Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ Licenses/by/3.0/legalcode). Часть этой работы была выполнена в Стэнфордском Nano общий зал (SNSF), поддержке Национального научного фонда под награду ECCS-1542152. Металлофизики признает поддержку от национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здравоохранения (32GM 008412). C.M.M. признает поддержку от НРСА низ предварительного докторских стипендий (F31 EB020502) и программу Siebel ученых. S.C.H. признает поддержку от национальных институтов здравоохранения (U19 AI116484 и R21 EB018407), Национальный научный фонд (DMR 1508006) и Калифорнийского института регенеративной медицины (RT3-07948). Это исследование получил финансирование от Альянса для восстановительной реабилитации исследования и обучение (AR3T), который поддерживается Юнис Кеннеди Шрайвер национального института детского здоровья и развития человека (NICHD), Национальный институт Неврологических нарушений и инсульта (NINDS) и Национальный институт биомедицинских изображений и биоинженерии (NIBIB) национальных институтов здравоохранения под номером P2CHD086843 премии. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают мнения национальных институтов здоровья.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
Riferimenti
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
- Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
- Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
- Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
- Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
- Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
- McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
- McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
- Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
- Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
- Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
- Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
- Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
- Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
- Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
- Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).
