Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D
Summary
Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.
Abstract
Técnicas bidimensionales (2D) cultivo de tejidos han sido esenciales para nuestra comprensión de la biología de la célula fundamental. Sin embargo, la falta de sistemas de cultura de tejido tradicional 2D una matriz (3D) tridimensional, dando como resultado una importante desconexión entre resultados obtenida in vitro e in vivo. Para solucionar esta limitación, los investigadores han diseñado plataformas de cultivo de tejidos de hidrogel 3D que pueden imitar las propiedades bioquímicas y biofísicas del microambiente de la célula en vivo . Esta investigación ha motivado la necesidad de desarrollar plataformas de material que soportan encapsulación celular 3D y posteriores ensayos bioquímicos. Ingeniería de proteínas recombinantes ofrece un único conjunto de herramientas para desarrollo y diseño de material de hidrogel 3D por lo que permite el control específico de la secuencia de la proteína y por lo tanto, por extensión, las propiedades mecánicas y bioquímicas potenciales de la resultante matriz. Aquí, presentamos un protocolo para la expresión de derivados por vía recombinante como elastina proteína (ELP), que puede utilizarse para forma hidrogeles con propiedades mecánicas independientemente ajustables y la concentración de ligando adhesivo celular. Además presentamos una metodología para la encapsulación de la célula en hidrogeles ELP y posterior tinción inmunofluorescente de encajado las células para posteriores análisis y cuantificación.
Introduction
Durante el siglo pasado, cultivo de tejidos de dos dimensiones (2D) se ha convertido en un conjunto de herramientas integral para el estudio de biología fundamental de la célula en vitro. Además, los protocolos relativamente barato y simple para el cultivo celular 2D han conducido a su adopción a través de muchas disciplinas biológicas y médicas. Sin embargo, más allá de la investigación ha demostrado que las plataformas 2D tradicionales pueden conducir a resultados que se desvían marcadamente de los recogidos en vivo, causando tiempo precioso y financiación en vano para la investigación clínico1,2, 3. Nosotros y otros presumen que esta discrepancia puede ser atribuida a la falta de nativos señales bioquímicas y biofísicas a las células cultivadas en las superficies de la 2D, que pueden ser necesarias para la óptima proliferación y maduración de diversos tipos celulares.
Para hacer frente a estas limitaciones y ayuda el puente de la brecha entre 2D estudios in vitro e in vivo , los investigadores tienen plataformas de hidrogel (3D) tridimensional desarrollado para la encapsulación de la célula1,4,5 ,6. Los hidrogeles son materiales ideales para recapitular el microambiente endógeno de la matriz extracelular (ECM) en vivo debido a sus propiedades mecánicas como de tejido y estructura hinchada de agua que permite el rápido transporte de nutrientes y señalización de factores de7,8. Además, 3D hidrogeles pueden diseñarse para tener control independiente sobre las propiedades mecánicas y bioquímicas del andamio. Matriz mecánica9,10,11,12 y ligandos de células adhesivas13,14,15 son bien sabido para influir en la célula comportamiento en vitro y en vivo. Así, los hidrogeles 3D con propiedades ajustables ofrecen una plataforma para estudiar las relaciones de causalidad entre las células y su microambiente. Criterios para una matriz hidrogel 3D ideal incluyen encapsulación de células simple, no citotóxica como independiente afinabilidad de fisiológicamente relevantes propiedades mecánicas e imitadores de motivos adhesivo celular nativos.
Tanto sintético (e.g., polietilenglicol, ácido poliláctico, poli (ácido glicólico)) y origen natural (por ej., alginato, colágeno, Matrigel) hidrogeles tienen ventajas sobre las plataformas de cultura 2D en vitro ; sin embargo, también tienen importantes deficiencias que limitan su aplicabilidad. Primero, muchas plataformas sintéticas y de origen natural requieren condiciones de reticulación áspero que pueden ser potencialmente tóxicas para las células mamíferas, conduce a disminución de la viabilidad de la célula7. Además, muchas plataformas sintéticas carecen de actividad biológica nativa y deban ser funcionalizados mediante reacciones químicas secundarias, que pueden agregar mayor complejidad y costo16. Finalmente, mientras que los materiales de origen natural contienen típicamente intrínsecos dominios bio-activo, a menudo se ven afectadas por la alta variabilidad de lote a lote y a menudo se limitan a formar geles relativamente débil7,17.
Ingeniería de proteínas recombinantes presenta un conjunto único de herramientas para el diseño de materiales por lo que permite el control explícito de secuencia de la proteína y, por extensión, las propiedades mecánicas y bioquímicas potenciales de hidrogel final andamio18. Además, aprovechando la maquinaria biológica conocida de Escherichia coli (e. coli) para expresar proteínas materiales pueden producir rentable y consistente con variabilidad limitada inter y intra-lote. La proteína elastina-como (ELP) presentada aquí tiene tres dominios modificados: (1) una etiqueta T7 y His6 que permite mediante fluorescencia de etiquetado etiquetado anticuerpos, (2) una región de ‘elastina-como’ que le confiere propiedades mecánicas elásticas y permite para química reticulación y (3) una región de ‘bio-activo’ que codifica para celular-adhesivo motivos.
Nuestra región de elastina-como se basa en la canónica (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) secuencia de elastina5 donde cuatro de lo Xaa sitios del aminoácido isoleucina (Ile), pero podrían ser diseñado para ser cualquier aminoácido, excepto prolina. Esta secuencia dota ELPs recombinantes con bajo comportamiento de temperatura (LCST) de solución crítica que pueden ser aprovechados para la expresión posterior purificación simple vía termal ciclismo19,20. Esta propiedad LCST puede ajustarse al agregado térmicamente a diferentes temperaturas modificando el huésped ‘Xaa’ residuo21,22.
Aquí, la posición de ‘Xaa’ en una de las cinco repeticiones de elastina-como ha sido reemplazada con el presentación de Amina lisina (Lys) aminoácido, que se utiliza para la reticulación de hidrogel. Nuestro trabajo previo ha demostrado no citotóxico y robusto reticulación vía la reacción con los reactivos amina crosslinker tetrakis (hidroximetil) fosfonio cloruro (THPC)23. Variables proteína contenido y crosslinker concentración total, somos capaces de producir hidrogeles que pueden ajustarse para abarcar un rigidez fisiológicamente relevante gama (~0.5-50 kPa)9,23,24. Además de afinar características mecánicas, adhesión celular dentro del hidrogel resulta de la integración de dominios de células adhesivas canónicos dentro de la columna vertebral de la proteína de la ELP. Por ejemplo, la incorporación de la secuencia de aminoácidos derivados de fibronectina extendida ‘RGDS’ permite la adhesión celular y flexibilidad conformacional, mientras los revueltos, variante de ‘RDGS’ no vinculante restringe de adhesión célula-matriz24. Modulando la relación de la célula-adhesivo para proteínas no-adhesiva, así como la concentración de proteína total, somos capaces de producir efectivamente hidrogeles que abarcan una amplia gama de la concentración de ligando. Consecuencia, hemos desarrollado una plataforma de hidrogel con propiedades bioquímicas y biofísicas desconectadas, que pueden ajustarse independientemente para una óptima cultura 3D de diversos tipos celulares.
Además de rigidez de la matriz y afinabilidad ligando adhesivo, hidrogeles recombinantes ofrecen la capacidad de diseño perfiles de degradación del material específico, que es necesaria para separarse de la célula, la proliferación y la migración dentro de un contexto 3D4 , 9. esta degradación es ofrecida por secreción celular de las proteasas que dirigidas específicamente prolongado ‘RGDS’9 o elastina-como secuencia25. Hidrogeles ELP también han demostrado para los posteriores ensayos bioquímicos que son necesarios para el estudio de viabilidad celular y la función incluyendo immunocytochemistry, así como la extracción de ADN/ARN/proteína para reversa cuantitativa reacción en cadena de la transcripción-polimerasa (qRT-PCR) y Western blot9. ELP variantes también se han utilizado en un número de modelos en vivo y son conocidas por ser bien tolerado por el sistema inmune26.
Tomados en conjunto, ELP como una plataforma material para estudios de encapsulación celular cuenta con una amplia variedad de ventajas en comparación con plataformas de material sintético o de origen natural, que carecen a menudo el mismo grado de afinabilidad bioquímica y Biofísica y reproducibilidad. Además, no citotóxico un de ELP uso sencillo y con una gran variedad de tipos celulares (por ej., chick raíz dorsal ganglia14,24, progenitoras neurales murinos células9,27, bovina de las células troncales mesenquimales humanas condrocitos neonatal28, human endothelial células29,30) permite que un modelo más fisiológicamente relevante del endógeno ECM 3D en comparación con el cultivo celular 2D. Adjunto, presentamos un protocolo para la expresión de derivados por vía recombinante, TEKS para el uso como plataforma de hidrogel regulables para 3D encapsulación de la célula. Además presentamos la metodología para el down-stream fluorescente etiquetado y microscopia confocal de células encapsuladas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Purificación y expresión de la proteína recombinante es una herramienta poderosa para sintetizar biomateriales con alta reproducibilidad. Debido en gran parte a la llegada de la clonación molecular comercializada, plásmidos recombinantes personalizados pueden adquirirse de varios proveedores, que reduce significativamente el tiempo para trabajar con materiales como el ELPs. Del mismo modo, plásmidos pueden solicitarse directamente en el laboratorio de origen, cuando la obra original fue respaldada por un contrato f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen T. Palmer y H. Babu (Neurocirugía de Stanford) para proporcionar murino NPCs. Vector art en la figura 4 fue utilizado y adaptado de Servier arte médico bajo licencia Creative Commons Atribución 3.0 Unported (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte de este trabajo fue realizado en la Stanford Nano comparte instalaciones (FNS), apoyado por la National Science Foundation bajo premio ECCS-1542152. N.A.S. agradece apoyo del Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud (32GM 008412). C.M.M. reconoce apoyo de un NIH NRSA becas predoctorales (F31 EB020502) y el programa Siebel. S.C.H. reconoce apoyo de los institutos nacionales de salud (U19 AI116484 y R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) y el Instituto de California de medicina regenerativa (RT3-07948). Esta investigación recibió financiamiento de la Alianza para la investigación Regenerativa de rehabilitación y capacitación (AR3T), que es apoyada por la Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD), Instituto Nacional de Desórdenes neurológicos y movimiento (NINDS) e Instituto Nacional de imágenes biomédicas y bioingeniería (NIBIB) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P2CHD086843. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
Riferimenti
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