Fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para realizar un fraccionamiento celular simple para la separación subcelular de proteínas citoplásmicas y nucleares en biopsias intestinales humanas frescas y congeladas.
Abstract
El propósito de este protocolo es fraccionar tejido intestinal humano obtenido por endoscopia en compartimentos citoplásmicos y nucleares para el análisis de localización de proteínas específicas o complejos de proteína en Estados diferentes del tejido (es decir, saludable frente a la enfermedad). Este método es útil para el fraccionamiento de ambas muestras de tejido intestinal frescos y congelados; es fácilmente accesible para todos los laboratorios y no requiere mucho tiempo.
Introduction
Las proteínas participan en casi todas las funciones biológicas dentro de una célula y cualquier variación en su estructura, la cantidad o la ubicación puede conducir a un escenario de patógeno. Métodos de fraccionamiento de muestras de tejido son un método útil para reducir la complejidad de la enfermedad relacionados con el análisis de la proteína. Algunos estudios utilizan información de localización de la proteína o enriquecen una proteína de un compartimento celular específico, por lo que un protocolo reproducible fraccionamiento de proteínas intactas es útil para responder a ciertas cuestiones biológicas. Determinación de la localización subcelular de las proteínas y vigilar su redistribución compartimentación o interacciones en basal y las condiciones de la enfermedad ayudará a identificar la enfermedad relacionada con las diferencias funcionales1,2. Así, este método pretende fraccionar reproducible las biopsias de tejido intestinal, frescas y congeladas, en compartimentos subcelulares citoplásmicas y nucleares.
Las muestras de biopsia intestinal habitualmente se obtienen durante la endoscopia procedimientos3 (figura 1) y pueden ser utilizadas eficazmente para la cuantificación de la proteína o los estudios de inmunoprecipitación. Puesto que las muestras de tejido del intestinal epitelios contiene proteínas que pueden estar directamente involucradas en la patogénesis de la enfermedad4, las muestras de biopsia intestinal son una fuente muy valiosa para la identificación exitosa de específicos de la enfermedad intestinal proteínas. Muestras de tejido congelado, paciente almacenados junto con la información clínica son recursos útiles para el análisis de la proteína, y una preparación simple y reproducible es una cuestión clave para proporcionar información de compartimentación celular utilizando cantidades limitantes de congelados tejido5.
Hay varios kits disponibles en el mercado para la separación de fracciones celulares, pero son más caras y generalmente más lento que el protocolo presentado aquí. Protocolos basados en varios pasos centrifugación degradado y gradientes continuos también se han utilizado previamente para el fraccionamiento de los diversos compartimentos celulares en diferentes tejidos6,7. Sin embargo, mantener la consistencia de gradientes continuos suele ser una tarea difícil. Similares protocolos basados en la secuencial lisis de las membranas se han descrito anteriormente pero generalmente necesitan más de dos tampones y las manos el tiempo es más largo8 .
Fraccionamiento de muestras de tejido, tener en cuenta ese tejido muestras presentes célula-célula y célula-matriz de interacciones que son no presentes en células cultivadas e importantes cuando proceder a la extracción de proteínas. El adecuado desglose entre células y matriz extracelular sin afectar la calidad de la proteína será un factor crítico en el tejido intestinal proteínas aislamiento9. En este protocolo, contactos célula-célula y célula matriz primero se rompen, liberando las células y permitiendo que el búfer llegar a las células individuales. Para evitar la proteína-compartimiento de mezcla antes del fraccionamiento, la ruptura de los contactos debe ocurrir sin alterar la integridad de las células o las membranas nucleares.
Por el enriquecimiento de distintas proteasas en la mucosa intestinal10, es importante para el control de la degradación de la proteína durante la extracción. Para minimizar la potencial degradación de las proteínas, múltiples inhibidores de proteasa deben incluirse en los buffers de extracción de proteína. Además, si extractos van a utilizarse para el análisis funcionales, es esencial para evitar la desnaturalización de las proteínas o la proteólisis, pues esto ocasionará una pérdida de proteína actividad11. Para ello, el protocolo se lleva a cabo a 4 ° C y fresco phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) se añade a los buffers en una concentración final de 0,1 mM justo antes de usar además inhibir la proteólisis.
El primer paso en el fraccionamiento celular es interrupción de tejido y lisis celular. Como se mencionó anteriormente, el objetivo es separar las células y les abren con mínimo daño de rotura. Las muestras de tejido intestinal deben ser homogeneizadas y lisis de las células para lograr máxima rotura de la membrana celular. En este protocolo, utilizamos una batidora de mano motorizado para romper el tejido intestinal que se homogeneiza dentro de segundos por medio de la acción de Vortex de alta velocidad. Después de la homogeneización, se incuban las células del tejido en un tampón hipotónico que estallará la membrana de la célula pero mantendrá los núcleos intactos, seguido por la adición de un detergente no desnaturalizantes (nonil phenoxypolyethoxylethanol) y un vortex corto para separar los núcleos de la fracción citoplasmática. Después de la separación del citoplasma, la membrana celular de los núcleos es irrumpió en un buffer hipertónico con agitación.
El método presentado aquí es un método adecuado para el fraccionamiento subcelular de las biopsias intestinales frescos y congelados que se han obtenido durante procedimientos endoscópicos y oscilan entre los 2 y 10 mg de peso. El protocolo es fácil y reproducible y se podría realizar utilizando equipos de laboratorio básicos y reactivos en menos de una hora.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo aquí descrito se utiliza para el fraccionamiento citoplasmático y nuclear de las biopsias intestinales. Las proteínas purificadas no son desnaturalizadas y puede ser utilizadas no sólo en el análisis de western blot como se muestra en la figura 2 y 3 y también en ensayos que requieren proteínas doblado nativo como inmunoprecipitación, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (página).
…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la asistencia de Ander Lopez y Miren Telletxea para video grabación y edición. ACR es financiado por una beca de Ikerbasque y un proyecto de investigación de Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). OCR es financiado por el proyecto ISCIII-PI16/00258 y cofinanciado por el Unión Europea FEDER/FSE “Una manera de hacer Europa”. ES financiado por una subvención de proyecto de investigación 2015111068 del Departamento vasco de sanidad. IRG y AJM son apoyados por becas de beca predoctoral de la UPV/EHU y el Departamento vasco de educación, respectivamente.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Riferimenti
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