Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen
Summary
Her viser vi hvordan du bruker en nærhet Ligation analysen (PLA) for å visualisere MST1/MST2 heterodimerization i fast celler med høy følsomhet.
Abstract
Regulert protein-protein interaksjoner er en retningsgivende for mange signalnettverk arrangementer, og oppdagelsen av slike hendelser er et viktig element i å forstå hvordan slike veier er organisert og hvordan de fungerer. Det finnes mange metoder å oppdage protein-protein interaksjoner i celler, men relativt få kan brukes til å oppdage interaksjoner mellom endogene proteiner. En slik metode, nærhet ligation analysen (PLA), har flere fordeler å anbefale bruk. Sammenlignet med andre vanlige metoder for protein-protein samhandling analyse, PLA har relativt høy sensitivitet og spesifisitet, kan utføres med minimal celle manipulasjon, og, i protokollen beskrevet her, krever bare to mål-spesifikke antistoffer avledet fra ulike arter (f.eks., fra mus og kaninen) og en spesialisert reagens: et sett med sekundær antistoffer som covalently knyttet til bestemte oligonucleotides at når brakt i nærheten av hverandre, opprette en amplifiable plattform for i situ PCR eller rullende sirkel forsterkning. I denne presentasjonen viser vi hvordan du bruker PLA teknikken for å se endringer i MST1 og MST2 nærhet i fast celler. Teknikken er beskrevet i dette manuskriptet er særlig aktuelt for analyse av celle signalisering studier.
Introduction
Avbrudd MST1/Hippo signalnettverk er koblet til utviklingsforstyrrelser og kreft1. I pattedyr, aktivere kinaser MST1 og MST2 (phosphorylate) MOB1 og LATS1/2, som deretter phosphorylates og deaktiverer transcriptional co aktivatoren Ja-assosiert protein (YAP)2. I sin aktive (unphosphorylated) form har YAP kreftfremkallende aktivitet, styrke transkripsjon av celle spredning gener; motsatt, når YAP er inaktivert av Hippo veien, celle spredning er undertrykt og apoptose forfremmet3. I vev, MST1 og MST2 finnes hovedsakelig som aktiv homodimerer, men kreftfremkallende stimuli kan øke nivåene av MST1/MST2 heterodimerer, og slike heterodimerer er inaktiv4. Hvordan MST1/MST2 heterodimerization er regulert imidlertid dårlig forstått. Både homo- og heterodimerer er formidlet via interaksjoner mellom C-terminalen kveilet-coil regionene MST1 og MST2 kjent som SARAH domener5. Bruke en i situ vist PLA i denne artikkelen viser vi tilstedeværelsen av MST1/MST2 heterodimerer i menneskelig Schwann celler (HSC) og menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293). PLA har en fordel over andre protein/protein samhandling gjenkjenningsmetoder fordi gjør påvisning av endogene protein-protein interaksjoner, som kan identifiseres og kvantifisert uten behovet av transgene uttrykk eller bruk av epitope tags 6.
Signalnettverk signaltransduksjon trasé er i stor grad kontrollert av betinget association komponent proteiner. For eksempel fører stimulering av de fleste receptor tyrosine kinaser til homo – eller hetero-dimerization og påfølgende tilknytning ekstra intracellulær signalnettverk proteiner, som selv skjemaet ytterligere komplekser. Formålet med metoden PLA er å visualisere nærhet mellom proteiner i celler, forutsatt at proteiner er mindre enn 30-40-nm fra hverandre. Protein nærhet oppdages vanligvis av første rugende cellene med passende primære antistoffer i ulike arter (f.eks., kanin og mus) mot hver samspill protein, deretter legge artsspesifikke sekundære antistoffer, pre kombinert til korte DNA sonder. Hvis DNA sonder i nærheten, kan en bestemt kobling DNA oligonucleotide samtidig binde begge disse sonder, danner en plattform for forsterkning ved i situ PCR eller rullende sirkel mekanisme. Fluorescerende kodene til forsterkning reaksjonen kan visualisering av samspill proteiner, som vises som fluorescerende prikker som lett kan kvantifisert og lokalisert til bestemte regioner i cellen7,8, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi fant det nyttig å bruke glass kammer lysbilder for dette eksperimentet, som det er veldig praktisk å utføre eksperimenter med flere (14-16) linjer og det er ikke nødvendig å endre utvalget hver gang under mikroskopi analyse. Noen komplikasjoner kan oppstå, som økt risiko for kryssforurensning med antistoffer. Derfor foreslår vi vaske hver brønn individuelt istedet for benytter en Coplin krukke, til tross for økt varighet av eksperimentet. I tillegg, fjerning av silikon sette er en delikat affære og må gjø…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker hele Chernoff laboratorium for bidra til optimalisering og validering av denne protokollen, særlig Maria Radu og Galina Semenova. Vi takker også Andrey Efimov av cellen Imaging anlegget ved Fox Chase Cancer Center. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (R01 CA148805) å JC.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
Riferimenti
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
