Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie
Summary
Hier presenteren we een protocol om ruimtelijk en stoffelijk beoordelen de aanwezigheid van levensvatbare microbiota in de ingewanden van de teek met behulp van een gemodificeerde geheel-mount kruising in situ-aanpak.
Abstract
Besmettelijke ziekten overgebracht door geleedpotigen vectoren blijven een belangrijke bedreiging voor de menselijke gezondheid wereldwijd. De oorzaak van deze ziekten, pathogenen bestaan niet in isolement wanneer ze koloniseren de vector; Integendeel, ze waarschijnlijk gaan in interacties met resident micro-organismen in het lumen van de darm. De vector microbiota heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in pathogen transmissie voor verschillende vector-overgedragen ziekten. Of verblijvende bacteriën in de darm van de teek Ixodes scapularis , de vector van verschillende menselijke pathogenen Borrelia burgdorferi, waaronder teek overdracht van ziekteverwekkers beïnvloeden wordt niet bepaald. Wij vereisen methoden voor het karakteriseren van de samenstelling van de bacteriën die zijn gekoppeld aan de darm van de teek te vergemakkelijken van een beter begrip van de potentiële interspecies interacties in de darm van de teek. Geheel-mount in situ kunt hybridisatie te visualiseren van RNA afschriften die zijn gekoppeld aan bepaalde bacteriesoorten voor de verzameling van kwalitatieve gegevens met betrekking tot de overvloed en distributie van de microbiota in onbeschadigde weefsel. Deze techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken van veranderingen in de gut microbiota milieu in de loop van de teek voederen en kan ook worden toegepast om te analyseren van de expressie van genen van de teek. Kleuring van hele teek lef opbrengst informatie over de bruto ruimtelijke verdeling voor target RNA in het weefsel zonder de noodzaak voor driedimensionale wederopbouw en minder wordt beïnvloed door verontreiniging van het milieu, die vaak kunstdiscours de sequencing-gebaseerd methoden vaak gebruikt bij het bestuderen van complexe microbiële gemeenschappen. Over het geheel genomen, deze techniek is een waardevol instrument dat kan worden gebruikt om beter begrijpen vector-pathogen-microbiota interacties en hun rol in de transmissie van de ziekte.
Introduction
Menselijke en dierlijke ziekteverwekkers overgedragen door geleedpotigen vectoren zijn wereldwijd te vinden en zijn goed voor ongeveer 20% van de infectieziekten wereldwijd1, maar effectief en veilig vaccins tegen de meeste van deze ziekteverwekkers zijn niet beschikbaar. Ons begrip van de belangrijke rol van commensale, symbiotische en pathogene micro-organismen, gezamenlijk bekend als de microbiome2, moduleren en de vormgeving van de gezondheid van bijna alle metazoans3 groeit. Het is nu duidelijk dat geleedpotigen vectoren van ziekteverwekkers ook darmflora haven en deze vector-geassocieerde microbiota is aangetoond dat de invloed van uiteenlopende vectoren overgedragen ziekteverwekkers4,5. De geleedpotigen microbiome is samengesteld uit eubacteria, archaea, virussen en eukaryote microben zoals protozoa, aaltjes en schimmels6. Echter, de overheersende onderzoek focus is op eubacteria, gedeeltelijk vanwege de beschikbaarheid van markers en verwijzing databases te identificeren specifieke bacteriële leden.
Met een focus op Ixodes scapularis, de teek vector van meerdere menselijke pathogenen Borrelia burgdorferi7, inclusief de verwekker van de ziekte van Lyme, de optimalisatie van een microbiële visualisatie techniek was erop gericht verbetering van ons begrip van de darmflora van de teek in het kader van vector-pathogeen interacties. Verschillende vragen moeten worden beantwoord in de teek microbiome veld. De darm is de site van de eerste uitgebreide ontmoeting tussen de teek en de binnenkomende ziekteverwekker in het kader van horizontaal overgedragen ziekteverwekkers; Daarom is inzicht in de rol van vector darmflora bij het moduleren van vector-pathogeen interacties zal onthullen zinvolle inzichten. Teken hebben een unieke wijze van bloedmeel spijsvertering, waar de verwerking van bloedmeel onderdelen neemt intracellulair8plaatsen. Het lumen van de darm schijnbaar fungeert als een vaartuig naar de bloedmeel bevatten als de teek-feeds, en nutriënten spijsvertering en assimilatie blijven na herverpakking voortvloeien gedurende de verschillende dagen van de voeding. De ziekteverwekkers verworven door de teek tijdens het voederen Voer het lumen van de darm samen met de bloedmeel en dus de lumen wordt een primaire site van interacties tussen de teek, pathogenen en resident microbiota. Zoals spijsvertering via de herverpakking en Ixodid teek Rui verloopt, ondergaat de darm structurele en functionele wijzigingen9. De samenstelling en de ruimtelijke organisatie van gut bacteriën is ook waarschijnlijk om te variëren in concert met de veranderende milieu van de darm. Het is daarom belangrijk om te begrijpen van de architectuur van verblijvende bacteriën in de darm van de teek om volledig te begrijpen het samenspel van de teek, pathogenen en darmflora.
Moleculaire technieken voor het beschrijven van host-geassocieerde microbiota routinematig gebruik maken van high-throughput parallelle sequencing strategieën10 volgnummer bacteriële 16S ribosomal DNA (rDNA) te versterken. Deze strategieën sequencing omzeilen de noodzaak tot het verkrijgen van een culturen van specifieke bacteriën en geef een gedetailleerde beschrijving van alle bacteriële leden vertegenwoordigd in de steekproef. Toch zijn dergelijke strategieën verward door het onvermogen om te onderscheiden van milieu verontreinigingen van bona fide bewoners. Verder, bij de beoordeling van de monsters, zoals teken, die in grootte klein zijn en vandaar bevatten lage microbiota-specifieke DNA oplevert, de waarschijnlijkheid van versterking van milieucontaminanten is toegenomen11 en resulteert in de onduidelijke interpretatie van microbiome samenstelling. Functionele karakterisering in combinatie met de visualisatie van specifieke levensvatbare bacteriën zal daarom worden cruciaal voor het definiëren en onderscheiden de microbiome van de teek stoffelijk en ruimtelijk. Richting van dit doel profiteerde we van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie. Deze techniek wordt routinematig gebruikt ter beoordeling van gen expressiepatronen in organen en embryo’s12,13,14 en kunt semikwantitatieve analyse van meningsuiting via het gehele monster van belang. Dit verschilt van de traditionele in situ hybridisatie technieken die gebruik maken van weefselsecties en vaak uitgebreide analyse van verdeelde materiaal met een computationele vergadering te voorspellen van de expressie in de hele organen15vereist. Terwijl geheel-mount in het algemeen naar hele organismen12 verwijst, verwijst hier geheel-mount naar hele darmen of organen. De voordelen van het gebruik van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie aanpak om te beoordelen van de architectuur van de teek darmflora zijn multifold. De darm van de teek is samengesteld uit 7 paren van diverticula, elk paar variërend in de grootte16. De functionele verschillen, vink als iemand, onder deze diverticula, niet in de context van de teek biologie begrepen zijn, microbiota of teek-pathogeen interacties. Manipulaties van de darm die scheuren van de darm diverticula zou verdringen microbiota aanwezig zijn in het lumen van de darm of die losjes gekoppeld aan de darm en verkeerde interpretatie van de ruimtelijke lokalisatie van microbiota. Fluorescentie-geëtiketteerden RNA in situ hybridisatie is eerder gebruikt om te onderzoeken afschriften17 van de darm van de teek door vaststelling en individuele gut diverticula om sonde hybridisatie en te lokaliseren van B. burgdorferi te openen transcripties door segmenteren van paraffine-ingebedde hele teken18. Deze beide benaderingen vereisen manipulaties van de weefsels van de teek vóór hybridisatie die afbreuk aan de gut microbiota architectuur doen zou.
In dit verslag beschrijven we in detail het protocol te onderzoeken van levensvatbare teek darmflora met behulp van geheel-mount in situ hybridisatie (WMISH). Het gebruik van geheel-mount RNA in situ hybridisatie in staat stelt een globaal inzicht in de aanwezigheid en de overvloed van specifieke gut bacteriën in de verschillende regio’s van de darm en kan aansporen nieuwe inzichten in de teek gut biologie in het kader van pathogen kolonisatie en doorgeven. Verder is maakt het gebruik van RNA sondes gericht zijn tegen specifieke bacteriële RNA de ontdekking van levensvatbare bacteriën in de darm van de teek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit is het eerste gebruik van een geheel-mount in situ hybridisatie (WMISH) techniek te bestuderen van de microbiota van een geleedpotigen vector van ziekteverwekkers. Ons protocol werd aangepast van een gebruikt bij het bestuderen van de ontwikkeling in Drosophila en kikker embryo’s25,26. Geheel-mount RNA in situ hybridisatie is routinematig gebruikt voor het lokaliseren van gene afschriften ruimtelijk en stoffelijk27…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken oprecht Dr. Mustafa Khokha, Yale University, voor het verstrekken van het gebruik van de hulpbronnen van zijn laboratorium. Wij zijn dankbaar aan Mr. Ming-Jie Wu voor uitstekende technische bijstand. EF is een HHMI onderzoeker. Dit werk werd gesteund door een gift van de John Monsky en Jennifer Weis Monsky ziekte van Lyme onderzoeksfonds.
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
Riferimenti
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor’eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
