सीटू संकरण में पूरे माउंट द्वारा टिक हिम्मत में Microbiota के दृश्य
Summary
यहां, हम विशेष रूप से एक प्रोटोकॉल वर्तमान और अस्थाई टिक हिम्मत में व्यवहार्य microbiota की उपस्थिति का आकलन एक संशोधित पूरे का उपयोग कर-सीटू संकरण दृष्टिकोण में माउंट ।
Abstract
सन्धिपाद वैक्टर द्वारा संचारित संक्रामक रोगों दुनिया भर में मानव स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण खतरा पैदा करने के लिए जारी है । रोगजनकों इन रोगों के कारण, अलगाव में मौजूद नहीं है जब वे उपनिवेश वेक्टर; बल्कि, वे की संभावना आंत लुमेन में निवासी सूक्ष्मजीवों के साथ बातचीत में संलग्न हैं । वेक्टर microbiota कई वेक्टर जनित रोगों के लिए रोगज़नक़ संचरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया है । चाहे Ixodes scapularis टिक के पेट में निवासी बैक्टीरिया, अरै burgdorferi सहित कई मानव रोगजनकों के वेक्टर, रोगजनकों के प्रभाव टिक संचरण निर्धारित नहीं है । हम निस्र्पक के लिए तरीकों की आवश्यकता के लिए टिक पेट के साथ जुड़े बैक्टीरिया की संरचना की जरूरत है टिक पेट में संभावित प्रजातियों के संपर्क की एक बेहतर समझ की सुविधा । सीटू संकरण में पूरे माउंट का उपयोग कर आरएनए विशेष जीवाणु प्रजातियों के साथ जुड़े टेप कल्पना करने के लिए गुणात्मक और बरकरार ऊतक में microbiota के वितरण के बारे में डेटा के संग्रह के लिए अनुमति देता है । इस तकनीक को टिक खिला के पाठ्यक्रम पर पेट microbiota वातावरण में परिवर्तन की जांच करने के लिए और भी टिक जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण लागू किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है । पूरी टिक हिम्मत के दाग तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए की आवश्यकता के बिना ऊतक में लक्ष्य आरएनए के सकल स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी उपज और कम पर्यावरणीय संक्रमण से प्रभावित है, जो अक्सर अनुक्रमण आधारित पाया तरीकों अक्सर जटिल माइक्रोबियल समुदायों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया । कुल मिलाकर, इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि बेहतर वेक्टर समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-रोगज़नक़-microbiota बातचीत और रोग संचरण में उनकी भूमिका ।
Introduction
मानव और पशुधन सन्धिपाद वैक्टर द्वारा प्रेषित रोगजनकों दुनिया भर में पाए जाते है और संक्रामक रोगों के बारे में 20% विश्व स्तर पर के लिए खाते में1, लेकिन इन रोगजनकों के अधिकांश के खिलाफ प्रभावी और सुरक्षित टीके उपलब्ध नहीं हैं । खाना खानेवाला, सहजीवी और रोगजनक सूक्ष्मजीवों, सामूहिक रूप से microbiome 2 के रूप में जाना जाता है की महत्वपूर्ण भूमिका की हमारी समझ, नियमन और लगभग सभी metazoans 3 के स्वास्थ्य को आकार देने में विस्तार है । अब यह स्पष्ट है कि रोगजनकों के सन्धिपाद वैक्टर भी आंत microbiota बंदरगाह और इन वेक्टर-संबद्ध microbiota को विभिंन वेक्टर जनित रोगजनकों4,5प्रभावित दिखाया गया है । सन्धिपाद microbiome eubacteria, archaea, वायरस और eukaryotic रोगाणुओं जैसे प्रोटोजोआ, सूत्रकृमि, और कवक6से बना है । हालांकि, प्रमुख अनुसंधान फोकस eubacteria कारण पर किया गया है, भाग में, मार्कर जीन और संदर्भ डेटाबेस की उपलब्धता के लिए विशिष्ट बैक्टीरियल सदस्यों की पहचान ।
Ixodes scapularisपर एक ध्यान के साथ, अरै burgdorferi7सहित कई मानव रोगजनकों के टिक वेक्टर, लाइम रोग के प्रेरणा का एजेंट, एक माइक्रोबियल दृश्य तकनीक के अनुकूलन के उद्देश्य से किया गया था वेक्टर के संदर्भ में टिक आंत microbiota की हमारी समझ में सुधार-रोगज़नक़ बातचीत. टिक microbiome मैदान में जवाब देने के लिए कई सवाल रहते हैं । आंत टिक और क्षैतिज स्थानांतरित रोगजनकों के संदर्भ में आने वाले रोगज़नक़ के बीच पहली विस्तारित मुठभेड़ की साइट है; इसलिए, वेक्टर मॉडुलन में वेक्टर आंत microbiota की भूमिका को समझना-रोगज़नक़ बातचीत सार्थक अंतर्दृष्टि प्रकट होगा । ticks रक्त भोजन के पाचन की एक अनूठी विधा है, जहां रक्त आहार घटकों के प्रसंस्करण जगह लेता है intracellularly8। आंत लुमेन प्रतीत होता है एक पोत के रूप में कार्य करता है के रूप में रक्त भोजन को शामिल टिक फ़ीड, और पोषक तत्व पाचन और आत्मसात खिला के कई दिनों भर में पीछा करना और पोस्ट-repletion जारी है । खिलाने के दौरान टिक द्वारा अधिग्रहीत रोगजनकों bloodmeal के साथ आंत लुमेन दर्ज करें और इस तरह लुमेन टिक, रोगज़नक़ के बीच बातचीत का एक प्राथमिक साइट बन जाता है, और निवासी microbiota । के रूप में पाचन repletion और Ixodid टिक molting के माध्यम से आय, आंत संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन9से गुजरती है । संरचना और आंत बैक्टीरिया के स्थानिक संगठन भी बदलते आंत वातावरण के साथ संगीत कार्यक्रम में भिंन होने की संभावना है । यह है, इसलिए, टिक पेट में निवासी बैक्टीरिया की वास्तुकला को समझने के लिए पूरी तरह से टिक की पुनरावृत्ति, रोगज़नक़, और आंत microbiota समझ महत्वपूर्ण है ।
आणविक तकनीक का वर्णन करने के लिए मेजबान संबद्ध microbiota नियमित रूप से उच्च प्रवाह समानांतर अनुक्रमण रणनीतियों10 बढ़ाना और अनुक्रम बैक्टीरियल 16S राइबोसोमल डीएनए (rDNA) का उपयोग । इन अनुक्रमण रणनीतियों विशिष्ट बैक्टीरिया की axenic संस्कृतियों को प्राप्त करने और नमूना में प्रतिनिधित्व सभी बैक्टीरियल सदस्यों का एक में गहराई से वर्णन प्रदान करने की आवश्यकता को दरकिनार. फिर भी, इस तरह की रणनीतियों के लिए बोना ी निवासियों से पर्यावरणीय संदूषणों को भेद अक्षमता द्वारा पाए जाते हैं । इसके अलावा, जब नमूनों का आकलन, ऐसे ticks के रूप में, कि आकार में छोटे होते है और इसलिए कम microbiota विशिष्ट डीएनए पैदावार होते हैं, पर्यावरण दूषित पदार्थों के प्रवर्धन की संभावना बढ़ जाती है11 और के अस्पष्ट व्याख्या में परिणाम microbiome रचना. विशिष्ट व्यवहार्य बैक्टीरिया के दृश्य के साथ संयोजन के रूप में कार्यात्मक लक्षण वर्णन है, इसलिए होगा, को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हो और microbiome के विचार के लिए अस्थाई और स्थानिकी टिक । इस लक्ष्य की ओर हमने सीटू संकरण में पूरी-माउंट आरएनए का लाभ उठाया. इस तकनीक को नियमित रूप से अंगों और भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन करने के लिए12,13,14 और ब्याज की पूरी नमूना पर अभिव्यक्ति की semiquantitative विश्लेषण की अनुमति देता है प्रयोग किया जाता है । यह सीटू संकरण तकनीक जो ऊतक वर्गों का उपयोग और अक्सर एक अभिकलनी विधानसभा के साथ व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता के लिए पूरे अंगों में अभिव्यक्ति की भविष्यवाणी15पारंपरिक से अलग है । जबकि पूरे माउंट आम तौर पर पूरे जीवों को संदर्भित करता है12, यहां पूरे-माउंट पूरी हिंमत या अंगों को संदर्भित करता है । टिक आंत microbiota की वास्तुकला का आकलन करने के लिए सीटू संकरण दृष्टिकोण में पूरे माउंट आरएनए का उपयोग करने के फायदे मुख़्तलिफ़ हैं. टिक आंत diverticula के 7 जोड़े से बना है, प्रत्येक जोड़ी आकार में बदलती16। कार्यात्मक अंतर, यदि कोई हो, इन diverticula के बीच, टिक जीवविज्ञान के संदर्भ में समझ में नहीं आ रहे हैं, टिक microbiota या टिक-रोगज़नक़ बातचीत. पेट की जोड़तोड़ कि पेट diverticula टूटना आंत लुमेन या microbiota के स्थानिक स्थानीयकरण के अशुद्ध अर्थ में परिणाम के साथ शिथिल और संबंधित उन लोगों में मौजूद microbiota होता है । प्रतिदीप्ति- सीटू संकरण में लेबल आरएनए पहले टिक आंत की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है17 फिक्सिंग और व्यक्तिगत आंत diverticula खोलने के लिए सुनिश्चित करने के लिए जांच संकरण और information to B. burgdorferi टेप अनुभाग के द्वारा आयल-एंबेडेड पूरे ticks18। इन दोनों दृष्टिकोण संकरण से पहले टिक ऊतकों के जोड़तोड़ की आवश्यकता है कि आंत microbiota वास्तुकला को प्रभावित करेगा ।
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार से प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए व्यवहार्य टिक आंत microbiota का उपयोग कर पूरे माउंट सीटू में संकरण (WMISH) की जांच । सीटू संकरण में पूरे माउंट आरएनए के उपयोग की उपस्थिति और आंत के विभिन्न क्षेत्रों में विशिष्ट आंत बैक्टीरिया की बहुतायत की एक वैश्विक समझ में सक्षम बनाता है और रोगाणु के संदर्भ में टिक आंत जीव विज्ञान में नई अंतर्दृष्टि प्रेरणा सकता है औपनिवेशीकरण और संचरण । इसके अलावा, आरएनए जांच विशिष्ट बैक्टीरियल आरएनए के खिलाफ निर्देशित की टिक आंत में व्यवहार्य बैक्टीरिया का पता लगाने की अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह एक पूरे का पहला प्रयोग है सीटू संकरण (WMISH) तकनीक में माउंट रोगज़नक़ों के एक सन्धिपाद वेक्टर के microbiota का अध्ययन करने के लिए । हमारे प्रोटोकॉल Drosophila में और मेंढक भ्रूण25,26में विका…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ईमानदारी से अपने प्रयोगशाला संसाधनों का उपयोग प्रदान करने के लिए डॉ मुस्तफा खोखा, येल विश्वविद्यालय, धंयवाद । हम श्री मिंग के आभारी हैं-उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Jie वू । EF एक HHMI अन्वेषक है । इस काम के जॉन Monsky और जेनिफर वेट्स Monsky लाइम रोग अनुसंधान कोष से एक उपहार द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
Riferimenti
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