ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化
Summary
ここでは、空間的そして一時的変更されたホール マウント in situ ハイブリダイゼーションのアプローチを使用して目盛り根性で実行可能な微生物叢の存在を評価するためにプロトコルを提案します。
Abstract
節足動物ベクトルによる伝染病は、世界中の人間の健康に重大な脅威をもたらすし続けます。これらの病気を引き起こしている病原体は、彼らはベクトル; を植民地化するとき、単独では存在しません。むしろ、腸内腔の常駐微生物との相互作用に従事する可能性が高い。ベクトル内の細菌叢は、いくつかの媒介性疾患の病原体の感染に重要な役割を再生する実証されています。イクソデススカプラリス目盛り、ボレリアブルグドルフェリを含むいくつかの人間の病原体のベクトルの腸内常在細菌病原体のダニの伝送に影響を与えるかどうかは未定です。ティックの腸内で潜在的な種間相互作用の理解を容易にするダニ腸に関連付けられている細菌の組成を特徴付けるための方法が必要です。その場で全部マウントの使用特定の細菌種に関連付けられている RNA 転写産物を視覚化する交配できます豊かさに関する質的データの収集とそのまま組織の細菌叢の分布。この技術は、ダニの餌にわたって腸内細菌叢の環境の変化を調べるため、ティック遺伝子の発現を分析にも適用できます。三次元再構成を必要とせず、組織の標的 RNA の総空間分布については収量をガッツ全目盛りの染色としばしば混同法を用いた環境汚染の影響が小さい複雑な微生物群集を研究する頻繁に使用されるメソッド。全体的にみて、この手法はより良いするために使用できる貴重なツール ベクトル病原細菌の相互作用とその病気の感染における役割を理解します。
Introduction
節足動物ベクトルによって送信される人間と家畜の病原体が世界中1、しかし効果的な感染症の約 20% のグローバル アカウントし、安全なワクチンこれらの病原体のほとんどはご利用いただけません。総称マイクロバイ2、調節、およびほぼすべての多細胞動物3健康を形成して共生、環境共生・病原性微生物の重要な役割の私達の理解を拡大しています。今、またハーバー腸内細菌の病原体の節足動物ベクトル多様な媒介性病原体4,5に影響を与えるこれらのベクター関連微生物叢が示されていることが明らかです。節足動物のマイクロバイ真正細菌、古細菌、ウイルス、原虫、線虫、菌類6などの真核微生物で構成されます。ただし、優勢な研究の焦点されている真正細菌のため、一部では、マーカー遺伝子と細菌の特定のメンバーを識別するために参照データベースの可用性に。
イクソデススカプラリス、ボレリアブルグドルフェリ7,を含む複数の人間の病原体のベクターの目盛りを中心とライム病の病原微生物の可視化技術の最適化を目指したベクトル ・病原菌相互作用のコンテキストでティック腸内細菌の私達の理解を改善しています。ティック マイクロバイ フィールドで答えるべきいくつかの疑問が残っています。腸は、目盛りと水平方向に移された病原体; のコンテキストで受信の病原体との間の最初の拡張の出会いのサイトしたがって、ベクトル ・病原菌相互作用を調節することでベクトル腸内細菌の役割を理解すると、意味のある洞察が明らかになります。マダニは、吸血消化、血液の食事コンポーネントは処理場所8では細胞内のユニークなモードを持っています。栄養の消化と同化餌の数日中に結果として起きるの後補充や腸の内腔は一見ティック フィードとして血液の食事を含む容器として機能します。給餌中にダニによって取得した病原体に入る、吸血と共に腸内腔と内腔になるダニ、病原体、および常駐細菌間の相互作用のプライマリ サイト。消化の補充と脱皮マダニを通過、腸は構造と機能の変化9を経る。組成と腸内細菌の空間組織も変化する腸内環境とのコンサートでは異なる可能性が高いです。したがって、完全にダニ、病原体と腸内細菌の相互作用を理解する目盛りの腸内常在細菌のアーキテクチャを理解することが重要です。
ホスト関連付けられている細菌叢を日常的に記述するため分子技術は、増幅し、細菌の 16S リボソーム DNA (rDNA) をシーケンスに高スループット並列シーケンス戦略10を利用します。これらのシーケンスの戦略は、特定の細菌の無菌共生栽培を取得し、サンプルで表される細菌のすべてのメンバーの詳細な説明を提供する必要を回避します。それにもかかわらず、このような戦略は、善意の住民から環境汚染を区別する無力によって混同されます。さらに、サンプル サイズが小さいと、それゆえ低細菌固有の DNA が含まれているダニなどの評価の結果、環境汚染物質の増幅の可能性増加11とのあいまいな解釈の結果マイクロバイ組成物。特定の細菌の可視化と組み合わせて機能解析、したがって、重要になりますを定義し、時間的、空間的にダニのマイクロバイを識別します。私たちはこの目標に向かって交配その場全体マウント RNA を利用しました。このテクニックは、日常的に使用して臓器および胎仔の12,13,14の遺伝子発現パターンを評価する、目的の全体標本上式の半定量分析を可能します。これは交配技術従来の in situティッシュ セクションを利用し断面計算アセンブリ全体の臓器15で式を予測する材料の広範な解析は往々 に異なります。全体マウント一般的に全体の生物12を参照しますが、ここで全部マウントは全体の内臓や器官を指します。ティック腸内微生物叢のアーキテクチャを評価するために交配アプローチその場全体マウント RNA を使用する利点は、多重。ティック腸憩室の 7 ペア サイズ16の各ペアで構成されます。機能の違いこれら憩室の間で、いずれはダニの生物学の文脈で理解されていない場合は、細菌やダニ ・病原菌相互作用をチェックします。破裂腸憩室腸の操作は細菌叢腸内腔や腸内細菌叢の空間定位の誤解の結果と緩く関連付けられている内に存在を転置します。蛍光標識 RNAの in situハイブリダイゼーションを修正し、個々 の腸憩室プローブの交配を確保し、ボレリアをローカライズするティック腸成績17を調べる以前に利用されています。18全体ダニのパラフィン包埋の区分により成績証明書。これらの両方のアプローチでは、腸内細菌叢のアーキテクチャに影響を及ぼす交配前にティック組織の操作必要があります。
このレポートでその場で全部マウント交配 (WMISH) を使用して実行可能な目盛り腸内細菌を調べるプロトコル詳細に述べる。全体マウント RNAの in situハイブリダイゼーションの使用により、存在の国際理解と腸内のさまざまな地域で特定の腸内細菌の豊かさと病原体の植民地化のコンテキストでティック腸の生物学への新しい洞察に拍車をかける可能性があります。トランス ミッション。さらに、特定の細菌 RNA に対して指示される RNA プローブの使用が目盛りの腸内細菌の検出を可能します。
Protocol
Representative Results
Discussion
これは病原体の節足動物ベクトルの微生物叢を勉強する全体マウントの in situハイブリダイゼーション (WMISH) 技術の最初の使用。我々 のプロトコルは、カエル胚25,26、ショウジョウバエの研究に使われたから適応されました。全体マウント RNAの in situハイブリダイゼーションは、日常的に空間的の遺伝子の転写をローカライズに…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼の実験室のリソースの使用を提供する私たち心から感謝博士ムスタファ ・ Khokha、エール大学。優れたテクニカル サポートに呉明傑氏に感謝しております。EF は HHMI 捜査官です。この作品は、ジョン ・ Monsky、ジェニファー ヴァイス Monsky ライム病研究基金からの贈り物によって支えられました。
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
Riferimenti
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