Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme
Summary
Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.
Abstract
Bulaşıcı hastalıklar eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından iletilen insan sağlığı dünya çapında önemli bir tehdit devam. Bu hastalıklar neden patojenleri yok yalıtım modunda vektör kolonize zaman; Bunun yerine, onlar büyük olasılıkla etkileşimleri gut lümen içinde ikamet mikroorganizmalar ile meşgul. Vektör microbiota patojen iletim birkaç vektör kaynaklı hastalıklar için önemli bir rol oynamak için kanıtlanmıştır. Ixodes scapularis kene, Borrelia burgdorferi, dahil olmak üzere birçok insan patojenleri vektör gut yerleşik bakteri kene iletim patojenlerin etkisi olup olmadığını tespit değil. Biz yöntemleri olası türler arası etkileşimler kene gut daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için kene gut ile ilişkili bakteriler bileşimi karakterize için gerektirir. Bütün Dağı in situ kullanarak özellikle bakteriyel tür ile ilişkili RNA transkript görselleştirmek için hibridizasyon bereket ile ilgili nitel veri toplama ve sağlam doku microbiota dağıtımını sağlar. Bu teknik değişiklikler gut microbiota ortamında besleme kene boyunca incelemek için kullanılan ve kene genlerin ifade analiz etmek için de uygulanabilir. Bütün kene boyama hedef RNA dokusunda üç boyutlu yeniden yapılandırma için gerek kalmadan brüt mekansal dağılımı hakkında verim bilgi cesaret ve kez sıralama tabanlı zihnimi karıştıran çevresel kirlenme tarafından daha az etkilenir karmaşık mikrobiyal topluluklar çalışma için sık kullanılan bir yöntem. Genel olarak, bu tekniği daha iyi kullanılabilmesi için değerli bir araç vektör-patojen-microbiota etkileşimleri ve hastalık iletim içindeki rolü anlamak olduğunu.
Introduction
İnsan ve hayvan patojenler eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından aktarılan dünya çapında bulunur ve bulaşıcı hastalıklar yaklaşık % 20 genel olarak1, ama etkili hesap ve çoğu bu patojenlerin karşı güvenli aşı mevcut değildir. Oransal ve hemen hemen tüm metazoans3 sağlık şekillendirme ve microbiome2, topluca bilinen komensal, simbiyotik ve patojen mikroorganizmaların önemli rol anlayışımızı genişletiyor. Şimdi eklem bacaklılar vektörel çizimler patojenlerin Ayrıca gut microbiota liman ve çeşitli vektör kaynaklı patojenler4,5etkilemek için bu vektör ilişkili microbiota gösterilmiştir açıkça anlaşılmaktadır. Eklem bacaklılar microbiome eubacteria, Arkeler, virüsler, ökaryotik mikroplar gibi tek hücreli, nematodlar ve mantarlar6oluşur. Ancak, baskın araştırma odak eubacteria üzerinde nedeniyle, kısmen, işaretleyici genler ve belirli bakteriyel üyelerini tanımlamak için başvuru veritabanları kullanılabilirliğini olmuştur.
Ixodes scapularis, kene vektör Borrelia burgdorferi7, de dahil olmak üzere birden çok insan patojenlerin ile bir odak hastalığının Lyme hastalığı, bir mikrobiyal görselleştirme teknik optimizasyonu amaçlı yapıldı. kene gut microbiota vektör-patojen etkileşimleri bağlamında anlayışımızı geliştirmek. Kene microbiome alanında cevaplanması gereken birkaç soru kalır. Gut kene ve yatay olarak aktarılan patojenler bağlamında gelen patojen arasındaki ilk genişletilmiş karşılaşma sitesidir; Bu nedenle, vektör vektör-patojen etkileşimleri oransal olarak gut microbiota rolünün anlaşılması anlamlı yorumlara ortaya çıkaracaktır. Kene kan yemek sindirim, burada kan yemek bileşenleri alır işlenmesi intracellularly8yer benzersiz bir moduna sahip. Gut lümen görünüşte kene beslemeleri kan yemek içerecek bir gemi olarak hizmet vermektedir ve besin sindirim ve asimilasyon besleme birkaç gün doğmak ve sonrası repletion devam etmek. Kene tarafından besleme sırasında alınan patojenler gut lümen bloodmeal ile birlikte girin ve böylece lümen kene, patojen ve ikamet microbiota arasındaki etkileşimlerin birincil bir site olur. Sindirim repletion ve deri değiştirme iksodid kene ile devam ederken, gut yapısal ve işlevsel değişiklikler9uğrar. Kompozisyon ve gut bakteri mekansal organizasyonu değişen gut çevre ile uyum içinde değişebilir olasılığı mevcuttur. Bu, bu nedenle, yerleşik bakteri tamamen kene, patojen ve gut microbiota etkileşimi anlamak için kene gut mimarisini anlamak önemlidir.
Ana bilgisayar ilişkili microbiota rutin olarak açıklamak için moleküler teknikleri yükseltmek ve bakteriyel 16S ribozomal DNA (rDNA) sıra ile yüksek-den geçerek paralel sıralama stratejileri10 kullanmaktadır. Bu sıralama stratejileri aşmak gerek axenic belirli bakteri kültürleri elde etmek ve tüm bakteriyel Üyeler örnek temsil ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Yine de, bu stratejileri bona fide sakinleri çevre contaminations ayırt etmek için yetersizlik tarafından şaşırmış. Ayrıca, örnekleri, keneler, küçük içinde büyüklük ve bu nedenle düşük microbiota özgü DNA içeren gibi değerlendirmek verir, çevre kirletici amplifikasyon olasılığı artan11 olduğunu ve belirsiz yorumlanmasında sonuçları microbiome kompozisyon. Bu nedenle, belirli uygun bakteri görselleştirme ile birlikte işlev karakterizasyonu tanımlamak ve kene microbiome geçici ve dağınık şekilde ayırt için önemli olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon kullandı. Bu teknik gen ifade desenleri, organ ve embriyo12,13,–14 değerlendirmek için rutin olarak kullanılan ve ilgi tüm örnek ifade semiquantitative analiz sağlar. Bu doku bölümleri kullanmak ve genellikle kesitli malzeme tüm organları15ifadede tahmin etmek için sayısal bir derleme ile geniş Analizi gerektirir geleneksel in situ hibridizasyon teknikleri farklıdır. Burada bütün Dağı genelde bütün organizmalar12‘ ye anlamına gelir iken, Bütün Dağı bütün cesaret veya organları belirtir. Kene gut microbiota mimarisini değerlendirmek için bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon yaklaşımı kullanmanın yararları kesişmeyi. Kene gut boyutu16‘ değişen her çifti, divertikül, 7 çiftlerinden oluşur. Eğer bu divertikül arasında herhangi bir kene biyoloji, bağlamında anladım değil işlevsel farklılıklar microbiota veya kene-patojen etkileşimleri kene. Gut divertikül rüptürü manipülasyonlar, gut microbiota gut lümen veya gevşek gut microbiota kayma lokalizasyonu yanlış yorumlanmasına sonucu ile ilişkili mevcut yerinden. RNA in situ hibridizasyon floresans etiketli daha önce kene gut transkript17 sabitleme ve bireysel gut divertikül sonda hibridizasyon, B. burgdorferi yerelleştirmek üzere açma incelemek için kullanıldığında vardır transkript parafin gömülü tüm keneler18kesit tarafından. Bu her iki yaklaşımın gut microbiota mimari etkilerdi hibridizasyon önce kene dokuların manipülasyon gerektirir.
Bu raporda, Bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) kullanarak uygun kene gut microbiota incelemek için iletişim kuralı biz ayrıntılı olarak tarif. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon varlığı küresel bir anlayış ve belirli gut bakteri gut değişik bölgelerinde bolluk sağlar ve kene gut biyoloji patojen kolonizasyon bağlamında yeni görüşler teşvik ve iletim. Ayrıca, algılama kene gut uygun bakterilerin RNA probları karşı belirli bakteriyel RNA yönetmen kullanımına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu bir eklem bacaklılar vektör patojenlerin microbiota çalışmaya bir bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) tekniği ilk kullanmaktır. Bizim iletişim kuralı bir geliştirme Drosophila ve kurbağa embriyosu25,26çalışırdım adapte oldu. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon gen transkript dağınık şekilde yerelleştirmek için rutin olarak kullanılmıştır ve geçici27 ve transkript görselle?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz içtenlikle Dr. Mustafa Khokha, Yale Üniversitesi, onun laboratuvar kaynaklarının kullanımını sağlamak için teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım için Bay Ming-Jie Wu için sana şükrediyoruz. EF HHMI dedektif olduğunu. Bu eser bir hediyesi John Monsky ve Jennifer Weis Monsky Lyme hastalığı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
Riferimenti
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor’eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
