Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l’ibridazione in situ.
Abstract
Malattie infettive trasmesse da artropodi vettori continuano a costituire una grave minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Gli agenti patogeni che causano queste malattie, non esistono in isolamento quando essi colonizzano il vettore; piuttosto, essi probabilmente impegnarsi nelle interazioni con microrganismi residenti nel lume dell’intestino. Il microbiota di vettore ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella trasmissione di patogeni per parecchie malattie trasmesse da vettori. Se i batteri residenti nell’intestino della zecca Ixodes scapularis , il vettore di agenti patogeni umani diversi tra cui burgdorferi di Borrelia, influenzano trasmissione di graduazione degli agenti patogeni non è determinato. Abbiamo bisogno di metodi per caratterizzare la composizione dei batteri associati con l’intestino di graduazione per agevolare una migliore comprensione delle interazioni potenziali interspecie nell’intestino tick. Utilizzo intero-monta in situ ibridazione di visualizzare trascrizioni del RNA associate a particolari specie batteriche consente la raccolta dei dati qualitativi per quanto riguarda l’abbondanza e la distribuzione del microbiota in tessuto intatto. Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare le modifiche il milieu di microbiota dell’intestino nel corso del tick alimentazione e può essere applicata anche per analizzare l’espressione dei geni di segni di graduazione. Macchiatura di zecca tutta budella informazioni rendimento lorda distribuzione spaziale del target RNA nel tessuto senza la necessità di ricostruzione tridimensionale e risente meno di contaminazione ambientale, che spesso confonde il sequenziamento-based Metodi frequentemente utilizzati per lo studio di comunità microbiche complesse. Nel complesso, questa tecnica è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per meglio capire vettoriale-patogeno-microbiota interazioni e il loro ruolo nella trasmissione della malattia.
Introduction
Gli agenti patogeni umani e bestiame, trasmessi da artropodi vettori si trovano in tutto il mondo e rappresentano circa il 20% delle malattie infettive a livello globale1, ma efficace e sicuro vaccini contro la maggior parte di questi agenti patogeni non sono disponibili. Nostra comprensione dell’importanza del ruolo dei microrganismi commensali, simbiotici e patogeni, conosciuti collettivamente come il microbioma2, modulante e plasmare la salute di quasi tutti i metazoi3 si sta espandendo. Ora è evidente che anche Porto di artropodi vettori di agenti patogeni microbiota dell’intestino e questi microbiota vettoriale-collegata hanno dimostrato di influenzare diversi agenti patogeni vettore4,5. Il microbioma dell’artropodo è composto di eubatteri, archaea, virus e microbi eucarioti come protozoi, nematodi e funghi6. Tuttavia, il focus della ricerca predominante è stato il eubatteri dovuta, in parte, alla disponibilità di geni marcatori e banche dati di riferimento per identificare i membri batterici specifici.
Con un focus su Ixodes scapularis, tick vettoriale di agenti patogeni umani multipli compreso Borrelia burgdorferi7, l’agente eziologico della malattia di Lyme, l’ottimizzazione di una tecnica di visualizzazione microbica mirava a miglioramento della nostra comprensione del microbiota dell’intestino tick nel contesto delle interazioni di vettore-patogeno. Parecchie domande rimangono da risolvere nel campo microbiome tick. L’intestino è il sito del primo incontro esteso tra il segno di spunta e l’agente patogeno in arrivo nel contesto degli agenti patogeni orizzontalmente trasferiti; Pertanto, la comprensione del ruolo del microbiota dell’intestino vettoriale nel modulare le interazioni di vettore-patogeno rivelerà significativi approfondimenti. Le zecche hanno una modalità unica di digestione del pasto di sangue, dove l’elaborazione del pasto di sangue componenti prende posto intracellulare8. Lume dell’intestino apparentemente serve come recipiente per contenere il pasto di sangue come i feed di tick, e assimilazione e digestione nutriente derivarne durante i diversi giorni di alimentazione e continuare post replezione. Gli agenti patogeni acquisiti dal segno di spunta durante l’alimentazione Inserisci lume dell’intestino con le farine di sangue e il lume diventa così un sito primario delle interazioni tra il tick, agente patogeno e microbiota residente. Come digestione procede attraverso la replezione e zecche Ixodidae molting, intestino subisce modificazioni strutturali e funzionali9. È anche probabile che variano in concerto con il milieu di intestino cambiando la composizione e l’organizzazione spaziale dei batteri dell’intestino. Pertanto, è importante capire l’architettura di batteri residenti nell’intestino tick per comprendere appieno l’interazione di tick, agente patogeno e microbiota dell’intestino.
Tecniche molecolari per descrivere il microbiota host associato abitualmente utilizzano high throughput sequenziamento parallelo strategie10 per amplificare e sequenza DNA ribosomal 16S batterica (rDNA). Queste strategie di sequenziamento eludere la necessità di ottenere colture axeniche di batteri specifici e forniscono una descrizione approfondita di tutti i membri batterici rappresentata nel campione. Tuttavia, tali strategie sono confusi dall’incapacità di distinguere contaminazioni ambientali da residenti di bona fide . Ulteriormente, quando valutare i campioni, come le zecche, che sono di piccole dimensioni e quindi contengono DNA microbiota-specific basso cede, la probabilità di amplificazione di contaminanti ambientali è aumentato11 e risultati nell’interpretazione ambigua della microbioma composizione. Caratterizzazione funzionale in combinazione con la visualizzazione di specifici batteri vitali, pertanto, sarà fondamentale per definire e discernere il microbioma del battito temporalmente e spazialmente. Verso questo obiettivo, abbiamo approfittato dell’intero-monta RNA in situ ibridazione. Questa tecnica è usata ordinariamente per valutare il pattern di espressione genica in organi ed embrioni12,13,14 e permette l’analisi semiquantitativa dell’espressione sopra l’intero campione di interesse. Questo comportamento differisce da tecniche tradizionali in situ di ibridazione che utilizzano sezioni di tessuto e spesso richiedono un’approfondita analisi di materiale sezionato con un assembly computazionale per predire l’espressione in organi interi15. Mentre intero-monta si riferisce generalmente a interi organismi12, qui intero-monta si riferisce all’intero fegato o organi. I vantaggi di utilizzare l’intero-monta RNA in situ ibridazione approccio per valutare l’architettura del microbiota dell’intestino tick sono molteplici. L’intestino di graduazione è composto da 7 paia di diverticoli, ogni coppia variano in dimensione16. Le differenze funzionali, se qualcuno, tra questi diverticoli, non sono compresi nell’ambito della biologia di tick, tick interazioni microbiota o tick-patogeno. Manipolazioni dell’intestino che rompersi i diverticoli intestino sarebbero spostare il microbiota presente nel lume dell’intestino o quelle associate senza bloccare l’intestino e il risultato in un’interpretazione errata della localizzazione spaziale del microbiota. Fluorescenza-identificato RNA in situ ibridazione è stata utilizzata in precedenza per esaminare tick gut trascrizioni17 fissando e diverticoli intestino individuali per garantire l’ibridazione della sonda e per localizzare b. burgdorferi di apertura trascrizioni sezionando paraffina tutta zecche18. Entrambi questi approcci richiedono manipolazioni dei tessuti tick prima dell’ibridazione che interesserebbero l’architettura del microbiota intestinale.
In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo per esaminare il battito vitale microbiota dell’intestino intero-monta in situ ibridazione (WMISH). L’uso dell’intero-monta RNA in situ ibridazione consente una comprensione globale della presenza e abbondanza di batteri dell’intestino specifici nelle diverse regioni dell’intestino e può stimolare nuove intuizioni biologia di intestino tick nel contesto della colonizzazione del patogeno e trasmissione. Ulteriormente, l’uso di sonde di RNA nei confronti di specifico RNA batterico permette la rilevazione di batteri vitali nell’intestino tick.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo è il primo uso di una tecnica di ibridazione (WMISH) intero-monta in situ per studiare il microbiota di un artropodo vettore di agenti patogeni. Il nostro protocollo è stato adattato da quello utilizzato nello studio dello sviluppo in Drosophila che in rana embrioni25,26. Intero-monta RNA in situ ibridazione venga ordinariamente utilizzato per localizzare le trascrizioni del gene spazialmente e temporalmente27…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Università di Yale, per fornire l’uso delle sue risorse di laboratorio. Siamo grati a Mr. Wu Ming-Jie per l’eccellente assistenza tecnica. EF è un investigatore HHMI. Questo lavoro è stato supportato da un dono dal John Monsky e fondo per la ricerca di Jennifer Weis Monsky malattia di Lyme.
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
Riferimenti
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