Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Summary

Il gigante ciliati, Stentor coeruleus, sono un ottimo sistema per studiare la rigenerazione e la guarigione delle ferite. Vi presentiamo le procedure per stabilire colture cellulari Stentor da singole cellule o frammenti di cellule, inducendo la rigenerazione di cellule di taglio, chimicamente che inducono la rigenerazione della banda membranellar e apparato orale, imaging e l'analisi della cella rigenerazione.

Abstract

Le cellule hanno bisogno per essere in grado di rigenerare le parti per recuperare da perturbazioni esterne. Il ciliato unicellulare Stentor coeruleus è un organismo modello eccellente per studiare la guarigione della ferita e la rigenerazione delle cellule successive. Il genoma di Stentor è diventato disponibile recentemente, insieme ai metodi di biologia molecolare moderna, ad esempio RNAi. Questi strumenti rendono possibile studiare unicellulare rigenerazione a livello molecolare. La prima sezione del protocollo copre che stabilisce Stentor colture di cellule da singole cellule o frammenti di cellule, insieme a linee guida generali per il mantenimento Stentor culture. Stentor la coltura in grandi quantità consente l'utilizzo di strumenti preziosi come biochimica, sequenziamento e spettrometria di massa. Le sezioni successive del protocollo coprono diversi approcci per indurre la rigenerazione in Stentor. Manualmente taglio cellule con un ago di vetro permette di studiare la rigenerazione di parti di grandi cellule, mentre trattando le cellule con saccarosio o urea permette di studiare la rigenerazione delle strutture specifiche sull'estremità anteriore della cella. Viene fornito un metodo per le immagini singole celle rigenerante, insieme a una rubrica per sosta e analizzare la dinamica della rigenerazione. L'intero processo di rigenerazione è diviso in tre fasi. Visualizzando la dinamica della progressione di una popolazione di cellule attraverso le fasi, è dimostrato l'eterogeneità nei tempi di rigenerazione.

Introduction

Le cellule non sono semplici sacchetti di enzimi, ma piuttosto altamente complesse macchine i cui componenti sono accuratamente adattate alla dimensione corretta e disposti in posizioni ben definite. La morfogenesi delle cellule individuali rappresenta un processo chiave nella cellula e biologia dello sviluppo, ma il suo meccanismo molecolare è sconosciuto^1,2. Mentre alcune cellule coltivate assomigliano a BLOB, organismi unicellulari possono estremamente complicato architetture, esemplificati dal complessi corticali modelli visti nelle ciliati^3,4.

Forse l'esempio più estremo di una cellula altamente strutturata è Stentor coeruleus, un gigante heterotrichous ciliato in tiepidi Tetrahymena e Paramecium . Stentor è lungo 1 mm ed è coperto con più di 100 strisce longitudinali di pigmento blu alternate a righe di ciglia organizzato da stack in parallelo dei nastri dei microtubuli che corrono la lunghezza dell'intera cella. La cella è a forma di tromba (Figura 1), con una banda di membranellar e un apparato orale (OA) alle sue estremità anteriore e un peduncolo che si collega il cellulare al substrato alla sua estremità posteriore. Oltre la polarità chiaro antero-posteriore, la cella indica un distintivo patterning chirali, tale che la spaziatura tra righe ciliare gradualmente aumenta in senso orario. Questo si traduce in una discontinuità dove la riga più stretta incontra la riga più ampia e questa regione della superficie delle cellule, noto come il locus di contrasto striscia, può indurre la formazione del secondo set di strutture di estremità anteriore quando si innesta su un'altra cella⁵, rendendola formalmente equivalente all'organizzatore di Spemann. Così, tutti i processi chiave della biologia dello sviluppo hanno loro analoghi in Stentor: axiation, formazione di pattern e induzione. In un embrione, questi processi sono guidati da differenze di destino fra le diverse cellule, ma in Stentor, essi devono essere guidati da differenze di destino tra le diverse regioni all'interno di una singola cella. Ciò che definisce le differenze tra le regioni all'interno di Stentor è un mistero.

Se qualsiasi parte di Stentor è tagliato fuori, il pezzo mancante della cella può rigenerare per produrre una cellula normale in una questione di ore. Se una cella è tagliato a metà, o anche a pezzetti molto piccoli, ogni pezzo riorganizza in una cella di aspetto normale, ma più piccola e ripristina la proporzionalità tra cella parti^6,7. Anche piccolissimi frammenti, 1/64^th la dimensione della cella originale, sono in grado di rigenerare in una cella piccola ma normalmente proporzionata e quindi crescere per il full-size⁶. Stentor presenta dunque un'opportunità unica di studiare i meccanismi organello dimensione delle cellule e ridimensionamento della regolazione della crescita con metodi chirurgici che solitamente vengono applicate a livello di tessuti o interi organismi.

Una delle proprietà di Stentor che permette di rigenerare da una vasta gamma di operazioni chirurgiche è che contiene un macronucleo singolo nodulated (Figura 1) con circa 50.000 copie del genoma intero⁸. Come un frammento di cella contiene almeno un nodo macronuclear, ha la capacità di rigenerare completamente. Un'altra proprietà che sono alla base di Stentorabilità di rigenerazione è la sua capacità di guarigione prodigiosa. Anche se molti tipi delle cellule sono in grado di guarire le loro ferite⁹, Stentor è in grado di recuperare da una straordinaria gamma di perturbazioni fisiche. Un esempio di recupero Stentor da una perturbazione drastica, insieme ai metodi per visualizzare flusso citoplasmatico in Stentor¹⁰ precedentemente sono stati segnalati. Questi metodi consentono lo studio di come ferimento e successiva rigenerazione influenzano lo stato fisico del citoplasma.

Stentordi enormi dimensioni, capacità di rigenerazione straordinaria e il fatto che si manifesta molti dei fenomeni dello sviluppo visti in embrioni multicellulari (quali gli organizzatori, axiation e patterning) ha attirato molti biologi inerente allo sviluppo durante la girata del secolo scorso, tra cui Thomas Hunt Morgan⁷. Durante gli anni ' 50 e ' 60, approcci microsurgical hanno dimostrato una sorprendente gamma di processi rigenerativi e morfogenetici in questo organismo unicellulare¹¹. Tuttavia, Stentor è stato sviluppato come un sistema di modello di biologia molecolare solo recentemente. Nel corso degli ultimi anni, il genoma di Stentor è stato sequenziato e assemblato⁸, e il metodo per perturbare l'espressione genica mediante l'alimentazione di RNAi è stato sviluppato¹².

Uno dei motivi che Stentor è stato sviluppato in un organismo modello per la biologia molecolare moderna solo recentemente è stato la difficoltà di crescere grandi culture a causa di un lungo ciclo di cella (3-5 giorni). Tuttavia, i metodi moderni di genomica e proteomica richiedono meno materiale che hanno usato per, e il volume di una singola cella di Stentor è sufficiente per questi metodi, anche senza ricorrere a metodi ultrasensibili che sono stati sviluppati per l'analisi del singolo cellule che sono molto più piccole di Stentor. Sezione 1 del protocollo in dettaglio la procedura per la creazione di una grande cultura da una singola cellula Stentor . Lo stesso approccio può essere utilizzato per stabilire una grande cultura da un frammento di cellule ottenuta dal taglio di una cella. Sezione 1, inoltre, fornisce le linee guida per il mantenimento sano Stentor culture per lunghi periodi di tempo. Sezione 2 del protocollo fornisce la metodologia per indurre la rigenerazione delle cellule tagliando le celle manualmente con un ago di vetro. Sezione 3 del protocollo è dedicato ai due metodi di indurre la rigenerazione delle strutture cellulari specifici (membranellar band e orale apparato): trattando le cellule con saccarosio o urea conduce allo spargimento di queste strutture, seguite da loro rigenerazione. Sezione 4 del protocollo in dettaglio un metodo per l'imaging di singole celle rigenerante per lunghi periodi di tempo. Sezione 4 si conclude con la descrizione delle fasi di rigenerazione e suggerimenti sull'analisi delle dinamiche di rigenerazione.

Protocol

1. coltura Stentor e instaurazione delle colture Stentor da singole cellule o frammenti di cellule

1. Preparare la Chlamydomonas reinhardtii cultura per essere utilizzato come alimento per Stentor.
   1. Ottenere cellule Chlamydomonas reinhardtii da un fornitore commerciale (Tabella materiali).
   2. Stabilire una cultura liquida 500 mL di Chlamydomonas reinhardtii in supporti di rubinetto commercialmente disponibili usando una tecnica sterile¹³.
   3. Mantenere la cultura di Chlamydomonas sotto una lampada ad una concentrazione vicino a saturazione (a diametro esterno di circa 1) diluendo con rubinetto media due volte a settimana.
      Nota: La cultura di Chlamydomonas possa essere coltivata su un agitatore.
   4. Controllare regolarmente se la cultura di Chlamydomonas è sana mettendo una goccia di cultura su una diapositiva, coprendolo con un vetrino coprioggetto e archiviandola sotto un microscopio a ingrandimento 40x.
      Nota: Non utilizzare le impostazioni cultura per Stentor alimentazione se fosse stato contaminato da batteri o cellule Chlamydomonas sono aggregate in cluster. Se si verifica uno di questi problemi, avviare una nuova cultura di Chlamydomonas .
2. Ottenere Stentor coeruleus cellule da un fornitore commerciale (Tabella materiali).
3. Se le cellule Stentor sono necessari dal loro habitat naturale, è possibile raccoglierle da uno stagno, un lago o un fiume¹¹.
   1. Per raccogliere Stentor da uno stagno, lago o fiume, individuare un'area con alcuni vegetazione dove l'acqua è relativamente calmo, ombreggiato e chiaro.
      Nota: C'è una maggiore probabilità di trovare Stentor presso le sedi dove cresce la lenticchia d'acqua.
   2. Raccogliere almeno 2 L di acqua in un contenitore che è facile da versare da.
   3. Dopo detriti e particolato sono depositati alla parte inferiore del contenitore, delicatamente riempire pochi contenitori più piccoli da esaminare per Stentor, in attesa di pochi secondi dopo ogni raccolta per i detriti di stabilirsi nel grande contenitore.
   4. Una volta ultimata la raccolta di campioni in una posizione, spostare in una nuova posizione che è di almeno 10 m di distanza e ripetere il prelievo di campioni ci.
      Nota: Non ogni stagno ha una popolazione di Stentor , così possono avere molteplici stagni da campionare.
   5. Ritorno con i campioni al laboratorio e trasferire l'acqua dai contenitori nei singoli piatti Petri.
   6. In ogni capsula di Petri, cercare Stentor sotto uno stereomicroscopio con luce radente a 5 ingrandimenti. Trasferire le singole celle Stentor , utilizzando una pipetta da 1 mL in un pozzetto di una piastra di vetro posto contenente almeno 100 µ l di acqua di sorgente pastorizzato disponibile in commercio (PSW).
      Nota: Stentor cellule hanno una forma di tromba-come quando sono collegati a un substrato (Figura 1). Nuoto Stentor cellule sono meno estese rispetto alle cellule attaccate ad un substrato (Video 1).
   7. Lavare Stentor in PSW almeno 3 x. Eseguire i lavaggi rimuovendo circa il 90% dell'acqua dal pozzo, mantenendo le cellule Stentor nel pozzo, seguito aggiungendo 500 µ l di PSW nel pozzo.
      Nota: Prima di maneggiare Stentor utilizzando pipette con puntali da 10 µ l o più piccoli, tagliare l'estremità della punta della pipetta con le forbici per evitare di ferire le cellule grazie alle forze di taglio che vengono generate come una grande cellula scorre attraverso circa 0,5 mm troppo piccolo di un op di punta ening.
4. Preparare Chlamydomonas prima di ogni poppata di Stentor.
   1. Trasferire 1 mL di coltura di Chlamydomonas preparato come passaggio 1.1 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 2.095 x g per 3 min.
   2. Eliminare il surnatante e risospeso il pellet in 1 mL di PSW. Centrifugare a 2.095 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 µ l di PSW.
      Nota: Così, lavato e concentrato Chlamydomonas deve essere indicato come "preparato Chlamydomonas"nei passaggi seguenti. RUBINETTO media è dannoso per Stentor, così lavaggio Chlamydomonas prima alimentazione Stentor è importante.
5. Se è necessaria una cultura Stentor clonale, la cultura a partire da una singola cella di Stentor o un frammento di cella.
   1. Poiché celluli Stentor non crescono bene in PSW, preparare terreni condizionati dal filtro sterilizzante 500 µ l di contenuti multimediali da una cultura di Stentor esistente, sana.
   2. Trasferire 500 µ l di media condizionati in uno dei pozzetti di una piastra di vetro posto.
   3. Trasferire un Stentor nel pozzetto della piastra spot vetro contenenti terreni condizionati. Utilizzare come piccolo mezzo possibile per effettuare il bonifico.
   4. Alimentazione ogni Stentor 5 µ l di preparati Chlamydomonas ogni 48 h. Quando si dividono Stentor , contare il numero di cellule nel pozzo e aggiungere 5 µ l di preparati Chlamydomonas per cella.
   5. Tenere Stentor in un luogo ombreggiato, poiché le cellule sono sensibili alla luce (ad esempio, in scatole di plastica trasparente rivestito con carta assorbente).
   6. Cambio Stentor medium nel pozzo con fresco medium condizionato ogni 96h.
      1. Preparare fresco media condizionati come descritto al punto 1.5.1.
      2. Rendere tutte le celle di Stentor staccare dal fondo del pozzo pipettando delicatamente il liquido in su e giù nel pozzo.
      3. Aspirare accuratamente il liquido dal bene utilizzando una pipetta da 1 mL, assicurandosi che tutte le cellule rimangono nel pozzo. Aggiungere 500 µ l di fresco media condizionati al pozzo.
   7. Quando il numero delle cellule nel pozzo è superiore a 20, è possibile spostare le cellule in un contenitore più grande, ad esempio, un vaso di vetro a bocca larga.
      1. Aggiungere 20 mL di PSW in un vaso di vetro di bocca larga in autoclave.
         Nota: In autoclave di cristalleria per Stentor può essere sostituita con attenzione di lavaggio e di risciacquo.
      2. Attentamente pipettare i media su e giù nel pozzo per staccare tutte le cellule dal fondo del pozzo. Raccogliere tutte le celle di Stentor utilizzando una pipetta da 1 mL e trasferirli delicatamente il barattolo di vetro.
   8. Non serrare i coperchi su barattoli con culture Stentor , per consentire l'accesso sufficiente all'aria.
   9. Aggiungere PSW nel barattolo ogni 48 h per mantenere Stentor densità a circa 20 cellule/mL. Stimare la densità delle cellule dall'occhio.
      Nota: In alternativa, utilizzare una pipetta da 1 mL di aria bolla nel barattolo per rendere le celle staccare dalle pareti, pipetta da 1 mL della cultura e contare il numero di cellule nella punta della pipetta.
   10. Ogni 48 h, mangimi preparati Chlamydomonas Stentor culture in vasetti (Vedi punto 1.4). Iniziare con la cultura con 200 µ l di preparati Chlamydomonasdi alimentazione. Man mano che aumenta il volume della cultura, aumentare gradualmente la quantità di preparato Chlamydomonas utilizzato per l'alimentazione fino a 1 mL.
   11. Quando il volume di cultura raggiunge circa il 90% della capacità del vaso, è possibile trasferire la cultura in un contenitore più grande.
       1. Dispensare la cultura all'interno del vaso, su e giù, con una pipetta da 1 mL per staccare Stentor dal vetro.
       2. Versare l'intero contenuto del vaso in un contenitore di vetro 2-cup.
       3. Sciacquare il vaso con circa 25 mL di PSW nel contenitore di vetro 2-tazza per raccogliere il restante Stentor.
6. Mantenere sane culture in contenitori di vetro 2-cup.
   1. Nutrire le colture Stentor 2 mL di preparato Chlamydomonas per 100 mL di cultura ogni 4-5 giorni. Aggiungere PSW nel contenitore di vetro ogni 4-5 giorni per mantenere Stentor densità a circa 20 cellule/mL.
      Nota: 450 mL è il volume massimo che tiene un contenitore di 2 tazze.
   2. Una volta a settimana, ispezionare le culture sotto un 5 X microscopio per rotiferi, funghi e altre crescita di dissezione. Per prolungare la salute della cultura, rimuovere microrganismi contaminanti insieme con le cellule Stentor anormalmente a forma e incolore, utilizzando una pipetta da 1 mL.
   3. Quando il contenitore di vetro è riempito al 90%, dividere la cultura.
      1. Aggiungere 25 mL di PSW nel contenitore di vetro. Utilizzare una pipetta per pipetta di 25 mL su e giù per scollegare Stentor dal vetro. Circa il 50% della cultura di spostamento in un nuovo contenitore di vetro 2-cup.
      2. Aggiungere 25 mL di PSW in entrambe le culture e continuare a mantenere le due culture come descritto in questa sezione del protocollo.
         Nota: Poiché le cellule Stentor sono sensibili alle alte temperature, mantenere la temperatura a 25 ° C o inferiore in camera dove sono custodite le culture. In alternativa, le culture possono essere tenute in un'incubatrice. Fare riferimento alla tabella 1 per la risoluzione dei problemi di coltura Stentor .

2. che inducono la rigenerazione di cellule Stentor taglio

1. Utilizzare un estrattore di ago per fare parecchi aghi da tubi capillari utilizzando il programma come segue: pressione calore - 735, pull - 100, 150, velocità - tempo 110, - - 400.
2. Preparare una soluzione di metilcellulosa 4% in 50 mL di PSW.
   1. Aggiungere 1 g di metilcellulosa (viscosità: 1500 cP) a 50 mL di PSW.
   2. Incubare a 4 ° C per almeno 8 h facilitare la dissoluzione della metilcellulosa.
   3. Mantenere la soluzione di metilcellulosa 4% a temperatura ambiente.
3. Preparare una lastra di vetro posto per riporre i frammenti delle cellule dopo aver eseguito i tagli.
   1. Filtro sterilizzare file multimediali da una cultura sana, 500 mL per vetro posto piastra ben necessario.
   2. Trasferire 500 mL di terreno sterilizzato in ciascuno dei pozzetti necessari.
4. Raccogliere un sano Stentor (avendo una forma definita tromba, colore blu-verde vibrante e senza grandi vacuoli) in una goccia di 2 µ l e posto su un vetrino coprioggetto o diapositiva. Aggiungere 2 µ l di metilcellulosa 4% (Figura 2). Lasciate che Stentor rallentare prima del taglio (Video 2).
5. Tenere l'ago di vetro come parallela alla superficie di taglio possibile prevenire la rottura dell'ago.
6. Utilizzando uno stereo microscopio per dissezione, individuare la punta dell'ago di vetro e avvicinarlo alla cella (Figura 3A). Osservare il contratto Stentor al contatto con l'ago (Figura 3B e C).
   Nota: Se la cella è un orientamento che fa che separa la parte anteriore dal lato posteriore difficile, ruotarlo molto delicatamente con il lato dell'ago.
7. Premere delicatamente il contratto Stentor con il lato dell'ago di vetro per tagliare la cella in due (Figura 3D e Video 3). Spostare i due frammenti apart assicurando che non ci sia alcuna connessione citoplasmatica tra di loro, per evitare la fusione del frammento (Figura 3F).
8. Verifica se entrambi i frammenti hanno almeno un nodo macronuclear ogni esaminando i frammenti sotto un microscopio per dissezione con illuminazione obliqua.
   Nota: Avere almeno un nodo macronuclear è essenziale per la sopravvivenza delle cellule. La cella potrebbe far sua pellicola (guscio trasparente) insieme con il pigmento blu-verde, durante o dopo il taglio. Nella maggior parte dei casi, ciò non influirà la redditività a lungo termine della cella.
9. Spostare i frammenti nei pozzetti di una piastra di vetro posto preparato nel passaggio 2.3.
10. Taglio più celle perché una frazione delle cellule del tagliare non si rigenera.
11. Se eseguendo tagli multipli in un'unica sessione, è necessario sostituire l'ago di vetro quando esso diventa pesantemente rivestito con Stentor residuo o quando la sua punta è rotta. In alternativa, è possibile pulire l'ago strofinando delicatamente su un pezzo di distanziatore di silicio.
    Nota: Gli aghi di vetro possono essere utilizzati per più sessioni di taglio delle cellule.
12. Mantenere la lastra di vetro posto con frammenti di cellule in una camera umida.
13. Procedere alla sezione 4 del protocollo per i dettagli su formazione immagine e interpretazione dei risultati di rigenerazione Stentor .

3. indurre rigenerazione della Band Membranellar e apparato orale di saccarosio o trattamento di Urea

1. Membranellar band e orale rimozione apparato utilizzando saccarosio
   1. Preparare una soluzione al 25% di saccarosio in PSW.
   2. Aggiungere 500 µ l di 25% di saccarosio in PSW ad un tubo del microcentrifuge con una capsula.
   3. Preparare 3 microcentrifuga con Salvapercussori con 1 mL di PSW in ciascuna provetta per il lavaggio delle cellule dopo trattamento di saccarosio.
   4. Raccogliere 30-60 Stentor cellule in 1 mL di loro terreni di coltura in una microcentrifuga separato utilizzando una pipetta da 1 mL (Figura 4, freccia A).
   5. Raccogliere tutte le celle dal tubo in 125 µ l di volume finale utilizzando una pipetta di 200 µ l in una singola estrazione. Trasferirli al tubo con 500 µ l di 25% di saccarosio (preparato al punto 3.1.2) per ottenere 625 µ l di soluzione di saccarosio al 20% (Figura 4, freccia B). Avviare un cronometro.
   6. Incubare Stentor in questa soluzione di saccarosio al 20% e flick-spin il tubo del microcentrifuge nel rack per 1 min.
   7. Raccogliere tutte le celle in una singola estrazione (regolare la pipetta di capacità massima di 200 µ l per raccolta più facile).
   8. Mantenere le cellule nella punta della pipetta fino a quando il cronometro mostra 2 min di trattamento di saccarosio.
   9. Espellere Stentor in uno dei tubi del microcentrifuge preparati al punto 3.1.3 (Figura 4, freccia C). Flick-spin il tubo nel rack.
   10. Lavare le cellule due volte, una volta in ciascuna delle due restanti microcentrifuga contenente PSW preparata al punto 3.1.3 (Figura 4, frecce D ed E).
       Nota: Singola estrazione cellulare collezione tecnica non è importante tra i lavaggi.
   11. Procedere alla sezione 4 del protocollo per i dettagli su formazione immagine e interpretazione delle dinamiche di rigenerazione Stentor (Figura 4, frecce F e G).
2. Membranellar band e orale rimozione apparato utilizzando urea
   1. Preparare una soluzione di urea 4% in PSW.
   2. Aggiungere 300 µ l di 4% di urea in PSW ad un tubo del microcentrifuge con una capsula.
   3. Preparare 3 microcentrifuga con Salvapercussori contenente 1 mL di PSW in ciascuna provetta per il lavaggio delle cellule dopo trattamento di urea.
   4. Raccogliere 30-60 Stentor cellule in 1 mL di loro terreni di coltura in una microcentrifuga separato utilizzando una pipetta da 1 mL (Figura 4, freccia A).
   5. Raccogliere tutte le celle dalla provetta a 300 µ l di volume finale utilizzando una pipetta da 1 mL in una singola estrazione. Trasferirli al tubo con 300 µ l di 4% di urea (preparato al punto 3.2.2) per ottenere 600 µ l di soluzione di urea 2% (Figura 4, freccia B). Avviare un cronometro.
   6. Incubare Stentor in questo 2% soluzione di urea e flick-spin il tubo del microcentrifuge nel rack per 1 min.
   7. Raccogliere tutte le celle in una singola estrazione.
   8. Mantenere le cellule nella punta della pipetta fino a quando il cronometro mostra 2 min di trattamento di urea.
   9. Espellere Stentor in uno dei tubi del microcentrifuge preparati al punto 3.2.3 (Figura 4, freccia C). Flick-spin il tubo nel rack.
   10. Lavare le cellule due volte, una volta in ciascuna delle due restanti microcentrifuga contenente PSW preparata al punto 3.2.3 (Figura 4, frecce D ed E).
       Nota: Singola estrazione cellulare collezione tecnica non è importante tra i lavaggi.
   11. Procedere alla sezione 4 del protocollo per i dettagli su formazione immagine e interpretazione delle dinamiche di rigenerazione Stentor (Figura 4, frecce F e G).

4. imaging e l'analisi di rigenerazione delle cellule

1. Se utilizzando un microscopio in posizione verticale, utilizzare l'impiccagione metodo goccia per la rigenerazione dell'immagine di singole celle.
   1. Mettere 100 µ l di PSW in un pozzo di una lastra di vetro posto.
   2. Isolare 1 Stentor cella a 4 µ l di cultura media (il media che si trovano in), utilizzando un 10 o 20 µ l pipette. Depositare la goccia nel mezzo di un vetrino coprioggetto² di 22 x 22 mm (Figura 5).
      Nota: Se le cellule che sono 1) malsani (forma anomala o fortemente vacuolato) o 2) ancora hanno bande di membranellar o apparecchi orali (per esperimenti di trattamento chimico), non utilizzare per l'imaging.
   3. Organizzare 4 goccioline più di Stentor in terreni di coltura intorno la gocciolina precedente, lasciando abbastanza spazio tra le goccioline.
   4. Invertire il coprioggetto con le goccioline e delicatamente posto sopra il pozzetto della piastra vetro posto a cui PSW è stato aggiunto nel passaggio 4.1.
   5. Nota: PSW nel pozzo riduce al minimo l'evaporazione delle goccioline (Figura 5).
   6. Preparare le celle rimanenti per l'imaging seguendo passaggi 4.1.1 - 4.1.4.
   7. Immagine le cellule rigenerante sotto un microscopio con la risoluzione di tempo desiderato. In alternativa, osservare la rigenerazione utilizzando un microscopio stereo da dissezione.
      Nota: Rigenerazione inizierà immediatamente dopo il taglio di cella o trattamento con saccarosio o urea. Tuttavia, visibili nuove strutture orali formerà circa 3 h dopo l'inizio della rigenerazione.
2. Per ogni punto di tempo, una delle tre fasi di rigenerazione assegnare a ciascuna delle celle. Per effettuare questa operazione, confrontare ogni cella per le immagini rappresentative che illustrano le fasi (Figura 4 e Figura 6).
   1. Assegnare Stage 1 per le cellule che non hanno ancora una band membranellar (Figura 6A).
   2. Assegnare Stage 2 per le cellule con una banda di membranellar.
      Nota: Viene visualizzata una banda di membranellar 3-6 h dopo il trattamento (Figura 4, Figura 6B). Alla fine di questa fase, un'ulteriore curvatura dell'estremità posteriore della band membranellar apparirà appena prima che venga visualizzato un primordio orale.
   3. Assegnare Stage 3 per le cellule con un primordio orale.
      Nota: Un primordio orale è un'invaginazione che appaiono 6-8 h dopo il trattamento all'estremità posteriore della band membranellar (Figura 4, Figura 6 e 6D). Rigenerazione è completata quando le cellule hanno una banda di membranellar alle loro estremità anteriore e la forma di cellulare caratteristica tromba (Figura 4, Figura 6E). Maggior parte delle cellule Stentor sono completamente rigenerata all'interno di 8-9 h dall'inizio della rigenerazione.
3. Tracciare la percentuale delle cellule in ciascuna delle fasi di rigenerazione per ciascun punto di tempo sotto forma di un impilati box plot (Figura 7).
   Nota: Questo tipo di grafico permette la visualizzazione delle dinamiche di rigenerazione in una popolazione delle cellule.

Results

Stentor culture sono state stabilite in modo affidabile e mantenute da singole celle o frammenti di cellule utilizzando la sezione 1 del protocollo. Un esempio rappresentativo di una grande cultura sana è mostrato nel Video 1.

Il corso di tempo di rigenerazione è stato misurato in Stentor utilizzando il metodo di trattamento di saccarosio per l'avvio di rigenerazione descritta nel passo 3.1, combinato con l'imaging e il metodo di analisi descritto nella sezione 4 (Figura 7). Questo grafico indica che c'è una diffusione di uno-ora-lungo del tempo impiegato dalla popolazione delle cellule di raggiungere qualsiasi particolare fase. Questo tipo di analisi permette lo studio dell'eterogeneità temporale nel processo di rigenerazione in una popolazione di rigenerazione delle cellule.

Di seguito è riportato un riepilogo dei tempi di rigenerazione che sono stato osservato finora dopo decine di trattamenti di saccarosio (Figura 4 e Figura 6). Fase 1 è quando Stentor cellule sembrano lacrime senza qualsiasi banda di membranellar (questa fase inizia immediatamente dopo l'interruzione di saccarosio). Questa fase dura per 3-6 h. fase 2 è quando una banda di membranellar apparirà e cresce (3-6 h dopo il trattamento di saccarosio). Questa fase dura per 3-4 h. Stage 3 è quando un primordio orale viene visualizzato all'estremità posteriore della band membranellar (6-8 h dopo il trattamento di saccarosio), entrambe le strutture vengono spostate verso l'estremità anteriore della cella. Questa fase dura per 1-2 h. Quando la band di membranellar sia l'apparato orale ha raggiunto l'estremità anteriore della cella, questo indicato il completamento della rigenerazione. La cella ha adottato caratteristica Stentor tromba-come forma. Le cellule erano completamente rigenerati 8-9 h dopo il trattamento di saccarosio.

Figura 1. Istantanea di Stentor. La band membranellar e apparato boccale è mostrato all'estremità anteriore della cella. Il peduncolo è all'estremità posteriore della cella. Stentor macronucleo è nodulated. Un ben nutrito Stentor ha verdi vacuoli alimentari contenenti principalmente Chlamydomonas. Barra della scala è di 0,5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Set-up taglio Stentor . Il taglio delle cellule avviene modificando manualmente un ago di vetro mentre guardando la cella utilizzando un microscopio stereo da dissezione commercialmente disponibile. Lo scopo della carta è quello di fornire lo sfondo bianco per vedere le cellule meglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 3. Istantanee di 3 Video che illustra come tagliare un Stentor con un ago di vetro. (A) A Stentor immediatamente prima l'ago tocca. (B) un Stentor spremuto leggermente tra una diapositiva di ferro e vetro. (C) A contratto Stentor reagire alla forza dell'ago. (D) A Stentor taglianda premendo delicatamente sulla cella con il lato dell'ago. (E) A Stentor ora tagliata in due, ma non separati. (F) due Stentor frammenti. Barra della scala è di 0,25 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Visualizzazione schematica della sezione 3 e sezione 4 del protocollo. Si tratta di un protocollo illustrato per l'esecuzione di saccarosio o urea trattamento e l'osservazione di rigenerazione delle cellule. Il tempo indicato nel pannello inferiore è misurato dall'inizio del lavaggio 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Il programma di installazione per l'osservazione diretta e/o formazione immagine di rigenerazione con un microscopio dritto. In ogni goccia di 4 µ l appesi il vetrino coprioggetto, c'è una cella in fase di rigenerazione. Acqua nei pozzetti della piastra spot vetro limita l'evaporazione delle goccioline. Questa configurazione permette dopo la rigenerazione delle cellule multiple in parallelo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 6. Istantanee di Stentor in ogni fase della band membranellar e la rigenerazione dell'apparato orale. (A) fase 1 è caratterizzata da una forma a goccia-tipo delle cellule e l'assenza della band membranellar. (B) fase 2 è caratterizzato dalla comparsa della membranellar band, una struttura basata su ciglia che batte continuamente. Membranellar bande sono contrassegnati con linee bianche tratteggiate nei pannelli B - D. (C e D) fase 3 è caratterizzata dalla comparsa di primordio orale (contrassegnato con una freccia). Orale primordio appare come un'invaginazione all'estremità posteriore della band membranellar. Il primordio orale si muoverà quindi verso l'anteriore della cellula per diventare l'apparato orale. (E) rigenerazione viene completata quando la cella ha adottato la caratteristica forma a tromba Stentor , e apparato boccale (contrassegnato con una freccia) si è allargato all'estremità anteriore della cella. Barra della scala è di 0,25 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Impilati visualizzando trama scatola come proporzioni delle cellule in tutte le fasi di rigenerazione dopo il trattamento di saccarosio cambia nel passare del tempo. Il grafico mostra eterogeneità nella sincronizzazione delle fasi di rigenerazione all'interno di una popolazione di cellule rigenerante. "Numero di registrazione fine" indica il completamento della rigenerazione. Il numero di celle: 28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1. Esempio di una sana cultura Stentor . In genere, se una cultura è questo concentrato, spaccare la cultura è raccomandato. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 2. Rallentare Stentor con metilcellulosa. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 3. Taglio Stentor. Singole celle possono essere tagliate manualmente in più parti sotto uno stereo microscopio per dissezione premendo un ago di vetro attraverso la cella. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Problema con la cultura	Possibile rimedio	Prevenzione possibile
Cultura è sopraffatto da rotiferi o altri organismi di grandi dimensioni.	Rimuovere altretante Stentor possibili in una nuova piastra di coltura. Quindi lavare le cellule tre volte.	Lavare accuratamente Stentor quando riceverli, anche quando li acquista da un fornitore commerciale.
Cultura è sopraffatto da funghi o altri piccoli organismi.	Identificare un angolo dove ci sono meno Stentor. In quella zona, rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor e aggiungere nella nuova PSW. Mescolare delicatamente ma accuratamente per distrubuire gli organismi invasori. Saltare l'alimentazione successiva e Stentor li mangerà.	Osservare la cultura regolarmente e rimuovere piccoli contaminanti attraverso lo scambio di supporti per PSW fresco.
Stentor stanno ponendo in cima a vicenda.	Dividere la cultura in modo che la concentrazione è inferiore a 20 cellule/mL.	Dividere culture più spesso.
Stentor cellule sono accoppiamento.	Alimentazione ogni 4 giorni invece di ogni 5 giorni.
La cultura ha un sacco di materiale di scarto scuro.	Rimuovere la maggior quantità di materiale scuro, Stentor rifiuti, possibile senza rimuovere le cellule. Se Stentor sono attaccati al materiale scuro, pipettare su e giù per rilasciare le cellule Stentor dai loro rifiuti e quindi rimuovere il supporto con i rifiuti senza rimuovere le cellule. O, rimuovere quelli Stentor e mangimi di conseguenza meno.	Alimentazione Stentor 1ml meno cibo per 100 mL di cultura.
Dall'aspetto malsano (vacuolato/gonfio o arrotondati) Stentor.	Rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor celle e aggiungere nuova PSW.	Scambiare i media regolarmente.

Tabella 1. Guida alla risoluzione dei problemi per la coltura Stentor.

Discussion

Coltura Stentor presenta una serie di sfide. In primo luogo, per eseguire esperimenti che richiedono un numero elevato di cellule, uno ha bisogno di mantenere un gran numero di culture Stentor , come culture diventare malsane quando Stentor concentrazione supera 20 cellule/mL. In secondo luogo, gli organismi che possono contaminare Stentor culture spesso dividono più veloce di Stentor e sopraffare la cultura (un agente inquinante comune è rotiferi). Pertanto, è necessario controllare periodicamente la cultura sotto un microscopio e rimuovere i contaminanti. Occasionalmente, una nuova cultura deve essere avviato da un piccolo numero di cellule salvato manualmente da una cultura contaminata. Questo aumenta il tempo necessario per mantenere sano Stentor culture. In terzo luogo, espandendo una singola cella in una cultura di 400 mL richiede almeno un mese perché Stentor ciclo cellulare è 3-5 giorni. In quarto luogo, a differenza di altri modello ciliati, Stentor raramente andare in forma cistica ed essi non possono essere congelati.

Un aspetto importante della coltura Stentor è la selezione di un organismo di alimentazione adeguata. Precedentemente sono stati descritti vari metodi per la coltivazione Stentor . Uno di loro suggerisce di utilizzare latte scremato ai batteri di cultura che alimentano poi Stentor. Tale tecnica è efficace in coltura Stentor; Tuttavia, l'applicazione di tecniche genomiche richiede campioni puri per evitare confusione derivanti dalla genomiche letture da organismi non definito cibo. Utilizzando il protocollo attuale, Stentor può essere coltivata in massa e, perché il loro cibo, Chlamydomonas, è stato sequenziato, la presenza di contaminazione genomico dall'organismo dell'alimento possa essere rilevata e controllata per. Per ragioni sconosciute, tartaro dovuto ricostituire le sue scorte di ritornare dove trovò Stentor prima. Con il protocollo attuale, siamo stati in grado di mantenere Stentor per anni.

Esperimenti di rigenerazione con Stentor sono generalmente semplici, ma ci sono alcuni dettagli critici da tenere a mente. Per quanto riguarda la sezione 2, taglio Stentor cellule a metà possono essere masterizzate in pochi minuti. Mastering più avanzate procedure di microchirurgia di Stentor possono richiedere una settimana di pratica. Mentre effettuando un trattamento di saccarosio o urea (sezione 3), se all'inizio dell'imaging la maggior parte delle cellule hanno ancora loro bande membranellar, aumentare il tempo di incubazione di 10-30 s per quando saccarosio trattamento viene eseguito successivamente. Non aumentare il tempo di trattamento di saccarosio di là di incubazione 3 min perché il risultato sarà la morte delle cellule.

Imaging di Stentor rigenerazione richiede metodi di grandi cellule di immagine per lunghi periodi di tempo. Il metodo di imaging dettagliato nella sezione 4 è utilizzabile solo con un microscopio dritto. Se invece è disponibile un microscopio invertito, cellule posizionabile su una diapositiva o un vetrino coprioggetti in piccole camere. Un metodo è quello di creare una camera fuori di vaselina e coprire con un altro vetrino coprioggetto per evitare l'evaporazione. In alternativa, una camera per una singola cella può essere fatto facendo un buco con un punzone di foro della dimensione desiderata in un 1 x 1 cm² quadrati di distanziatore di silicio (tabella materiali), posizionare il distanziale su un vetrino coprioggetti, mettendo le cellule nella camera e che copre la camera con un altro vetrino coprioggetti. Quando imaging, se Stentor non sono con l'orientamento corretto per osservare le caratteristiche di ogni fase di rigenerazione, picchiettare con decisione per rendere il contratto di cella. Guarda la cella estendere per identificare la fase di rigenerazione (estensione completa richiede circa 45 s). Se la cella è ancora nell'orientamento sbagliato, ripetere il tapping. Le immagini mostrate nella Figura 1 e Figura 6 sono state scattate da un microscopio stereo zoom; Tuttavia, tutti gli esperimenti dettagliati possono essere eseguiti utilizzando un 5 X stereo microscopio per dissezione.

Un'altra sfida oltre a coltura e imaging Stentor è il monitoraggio della rigenerazione, in particolare la quantità di tempo necessario per identificare le fasi. Se la cella rigenerante è perfettamente orientata con la regione del primordio orale chiaramente visibile, identificazione della fase richiede pochi secondi. A volte, tuttavia, la cella Stentor è in un orientamento prevenzione chiara assegnazione della fase di rigenerazione, tenendo così più tempo per identificare. La notevole quantità di tempo necessario alla fase di singole celle rigenerante potrebbero ritardare la quantificazione di tutte le cellule rigenerante, diminuendo così la precisione temporale della messa in scena e che richiedono l'osservatore ad aspettare e ricreare l'immagine la cella dopo esso ha spostato a un nuovo orientamento. Di conseguenza, questo esperimento è sia di tempo che di alta intensità di manodopera. Per questi motivi, sarebbe altamente auspicabile sviluppare metodi automatici per la rilevazione di cellule Stentor e assegnazione fasi di rigenerazione in dati video microscopia. Questi consentirebbe anche per ulteriori esperimenti riproducibili, aumenta la dimensione del campione e la rimozione dei pregiudizi umani.

L'emersione dei metodi altamente sensibili di genomica e proteomica ha cominciato a mettere gli studi delle singole cellule in reach. Per tali analisi unicellulare, il formato gigante di una cella Stentor rende auspicabile cavia per esperimenti di proof-of-concept. Per tali esperimenti essere possibili, coltura Stentor è fondamentale, e quindi i metodi descritti qui dovrebbero giocare un ruolo in ulteriore sviluppo delle tecniche più avanzate di cella singola.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stentor coeruleus coltura viva	Carolina Biological Supply	131598
Chlamydomonas reinhardtii su agar	Carolina Biological Supply	152040
Acqua di sorgente pastorizzata, bottiglia da 1 litro	Carolina Biological Supply	132458
Metilcellulosa, 1500 cP	Millipore Sigma	M0387
Piastra spot in vetro Pyrex	Fisher Scientific	13748B
Barattolo in vetro a bocca larga con tappo a vite, 60 mL	Carolina Biological Supply	715740
Contenitore in vetro da 2 tazze con coperchio in vetro	Pyrex	1095600
CultureWell materiale in fogli di silicone	Grace Bio Labs	664475
Kimwipes	Kimberly Clark	34155
Provetta per microcentrifuga Posi-Click da 1,7 mL	Denville	C2170
Vetro di copertura	Fisher finest	12-548-B
Terreno di crescita TAP, ottimizzato per colture Chlamydomonas		A1379801
foglio in silicone CultureWell, spessore 0,25 mm/13 cm x 18 cm	Grace Bio Labs	664475
Vaselina, vaselina, spettro bianco		P1037
Tubi capillari in vetro borosilicato. OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, lunghezza: 10 cm.	Sutter Instrument	B120-90-10
Estrattore ad aghi P-87	Sutter Instrument
Stereomicroscopio Stemi 2000	Zeiss
Axiozoom V16, stereomicroscopio zoom	Zeiss