Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l'assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo - ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.
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Articolo metodologico
Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin
In questo articolo
Sommario
Abstract
FM coloranti vengono utilizzati per studiare il ciclo delle vescicole sinaptiche (SV). Queste sonde di amphipathic hanno una testa idrofila e coda idrofobica, rendendoli solubili in acqua con la possibilità di reversibilmente entrare ed uscire lipidici di membrana. Questi coloranti styryl sono relativamente non fluorescente in ambiente acquoso, ma inserire il foglietto esterno della membrana plasmatica provoca un > 40 X aumentare in fluorescenza. Nelle sinapsi neuronali, FM coloranti sono interiorizzati durante endocitosi SV, smerciata sia all'interno che tra piscine SV e rilasciato con esocitosi SV, fornendo un potente strumento per visualizzare le fasi presinaptici della neurotrasmissione. Un modello genetico primario di sviluppo di sinapsi glutammatergiche e funzione è la Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ), dove FM tingere imaging è stato ampiamente utilizzata per quantificare la dinamica di SV in una vasta gamma di condizioni mutante. Il terminale sinaptico NMJ è facilmente accessibile, con una bella serie di grandi boutons sinaptici ideale per applicazioni di imaging. Qui, mettiamo a confronto e contrasto i tre modi per stimolare la drosofila NMJ guidare tintura l'assorbimento/rilascio di attività-dipendente FM1-43: applicazione 1) vasca di alta [K+] a depolarizzarsi tessuti neuromuscolari, 2) del nervo motore elettrodo di aspirazione stimolazione a depolarizzarsi nervi presinaptici terminali e 3) mirati transgenici espressione delle varianti channelrhodopsin per luce-stimolato un controllo spaziale di depolarizzazione. Ciascuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi per lo studio degli effetti di mutazione genetica sul ciclo SV presso la drosofila NMJ. Discuteremo di questi vantaggi e svantaggi per facilitare la scelta dell'approccio stimolazione, insieme con le metodologie specifiche per ogni strategia. Oltre a formazione immagine fluorescente, FM coloranti possono essere photoconverted a elettrone-densi segnali visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per lo studio dei meccanismi di ciclo SV a livello ultrastrutturale. Forniamo i confronti di confocale e la microscopia elettronica imaging da diversi metodi di stimolazione di Drosophila NMJ, per aiutare a guidare la selezione dei futuri paradigmi sperimentali.
Introduzione
Il modello splendidamente caratterizzato Drosophila larvale della giunzione neuromuscolare (NMJ) glutamatergic sinapsi è stato utilizzato per studiare la formazione della sinapsi e funzione con un vasto spettro di perturbazioni genetica1. Il terminale del neurone di motore è costituito da più rami dell'assone, ognuno con molti boutons sinaptici allargata. Queste varicosità capiente (fino a 5 µm di diametro) contengono tutte la macchine di neurotrasmissione, comprese le vescicole sinaptiche glutamatergic uniforme (SVs; ~ 40 nm di diametro) nella riserva citosolico e facilmente rilasciabile piscine2. Queste vescic....
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Protocollo
1. larvale colla dissezione
- Mescolare bene 10 parti di elastomero di silicone base con 1 parte di elastomero di silicone induritore dal kit di elastomero (Tabella materiali).
- Cappotto 22x22 mm lamelle di vetro con l'elastomero e cura su un piatto caldo a 75 ˚ c per diverse ore (fino a quando non è più appiccicoso al tatto).
- Posizionare un coprioggetto in vetro rivestite con elastomero singolo nella camera di dissezione di vetro plexi su misura (Figura 1, in basso) in preparazione per la dissezione larvale.
- Preparare le pipette di colla dal capillare di vetro borosilicato con l'estra....
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Risultati
La figura 1 Mostra il flusso di lavoro per la tintura di FM di attività-dipendente imaging protocol. L'esperimento inizia sempre con la dissezione larvale colla stessa, indipendentemente dal metodo di stimolazione utilizzato successivamente. Figura 1a è un disegno schematico di una larva dissecata, mostrando il cavo ventrale del nervo (VNC), irradiando i nervi e pattern muscolari ripetute hemisegmental. Il VNC è rimosso e la prep.......
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Discussione
Alta [K+] Salina depolarizzazione stimolazione è di gran lunga la più semplice delle tre opzioni per tintura di FM di attività-dipendente in bicicletta, ma probabilmente il meno fisiologico29. Questo semplice metodo depolarizza ogni cellula accessibile nell'animale intero e così non permette studi diretti. Potrebbe essere possibile applicare localmente alta [K+] soluzione fisiologica con una micropipetta, ma questo sarà ancora depolarizzarsi cellule pre/post-sinaptica e proba.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri Broadie Lab per i contributi a questo articolo. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01s MH096832 e MH084989 di K.B. e nella comunione predoctoral NIH F31 MH111144 D.L.K
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di elastomeri siliconici SylGard 184 | Scientific | NC9644388 | Per applicare il vetro di copertura per le dissezioni |
| Vetro di copertura per microscopio 22x22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | Per applicare SylGard per le dissezioni |
| Piastra riscaldante superiore in alluminio Tipo 2200 | Thermolyne | HPA2235M | Per polimerizzare la |
| camera di dissezione in vetro | N/A | N/A | Fatto a mano |
| Capillari in vetro borosilicato | WPI | 1B100F-4 | Per fare l'aspirazione e incollare le micropipette |
| Estrattore per micropipette basato sul laser | Strumento Sutter | P-2000 | Per fare l'aspirazione e la colla delle micropipette |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | Per pipetta per bocca e aspirazione |
| P2 punta per pipetta | USA Scientific | 1111-3700 | Per pipetta per bocca |
| 0,6 ml Tappo per provette Eppendorf | Fisher Scientific | 05-408-120 | Utilizzato per mettere la colla per la dissezione |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Colla utilizzata per le dissezioni |
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | P-217 | Forsalina |
| Cloruro di sodio | Millipore Sigma | S5886 | Per soluzione salina |
| Cloruro di magnesio | Fisher Scientific | M35-500 | Per soluzione salina |
| Cloruro di calcio diidrato | Millipore Sigma | C7902 | Per soluzione salina |
| Saccarosio | Fisher Scientific | S5-3 | Per soluzione salina |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Per soluzione salina |
| HRP: Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | Per etichettare le membrane neuronali |
| Pennello | Winsor & Newton | 94376864793 | Per manipolare le larve |
| Dumont Dumostar Pinzetta #5 | WPI | 500233 | Utilizzato durante la dissezione |
| 7 cm McPherson-Vannas Microforbici (lame 3 mm) | WPI | 14177 | Utilizzato durante la dissezione |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | colorante di stirile |
| VWR | 62344-641 | Per la temporizzazione del carico/scarico del colorante FM | |
| LSM 510 META microscopio confocale a scansione laser | Zeiss | Per l'imaging dei marcatori fluorescenti | |
| Zen 2009 SP2 versione 6.0 | Zeiss | Software per l'imaging su laser confocale | |
| HeNe 633nm | Lasos | Per eccitare HRP:647 durante | |
| Laser Argon 488nm | Lasos | Per eccitare il colorante FM durante l'imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | Per lucidare a fuoco micropipette di vetro |
| 20mL Siringa Slip Tip | BD | 301625 | Per aspirare l'assone per la stimolazione elettrica. |
| Micro manipolatore (base magnetica) | Narishige | MMN-9 | Per controllare l'elettrodo di aspirazione per la stimolazione elettrica |
| Stimolatore Grass | S48 | Per controllare il LED e la stimolazione elettrica | |
| Zeiss Axioskop Microscopio | Zeiss | Utilizzato durante la stimolazione elettrica. | |
| Obiettivo a immersione in acqua Achroplan 40X | Zeiss | stimolazione elettrica e l'imaging confocale | |
| Millipore retinico all-trans | Sigma | R2500 | Co-fattore essenziale per ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscopio con porta per fotocamera | Zeiss | 2000-C | Utilizzato durante la stimolazione con canalrodopsina |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Utilizzato per l'attivazione di ChR |
| Driver LED T-Cube | ThorLabs | LEDD1B | Per controllare l'alimentatore LED |
| LED | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | Per alimentare il |
| potenza ed energia | a LED ThorLabs | PM100D | Per misurare l'intensità dei LED |
Riferimenti
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
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Ristampe e permessi
