미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론
Summary
여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.
Abstract
DNA 메 틸 화의 정량화는 황산 시퀀싱, 단일 가닥 DNA 컨텍스트에서 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 활용을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 중 아 황산 염 연속 수 대상 (PCR를 사용 하 여) 또는 전체 게놈에서 수행 하며 단일 기본 해상도에서 시 토 신 메 틸 화의 절대 정량화. 특히 이차 구조에에서 핵과 미토 콘 드리 아 DNA의 독특한 성격을 감안할 때, 조사에서 mtDNA 시 토 신 메 틸 화 황산 시퀀싱 방법의 적응 해야 한다. MtDNA의 2 차 및 3 차 구조 황산 황산 단일 가닥 dna의 불완전 한 변성 가난한 액세스 인해 가양성을 선도 하는 아티팩트를 시퀀싱 실제로 발생할 수 있습니다. 여기, 우리 사용 하 여 DNA의 효소 소화 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 함께 정확한 정량화의 시 토 신 메 틸 화 수준의 mtDNA에 있도록 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 mtDNA에 황산 시퀀싱 뇌관을 디자인 하기 위한 지침을 제공, 바람직하지 않은 핵 미토 콘 드 리아 세그먼트를 대상으로 하는 피하기 위하여 (NUMTs) 핵 게놈으로 삽입.
Introduction
미토 콘 드리 아 게놈은 약 16.5 킬로 베이스 (kb)의 원형, 더블-좌초 구조, 무거운 및 빛 가닥의 구성. 미토 콘 드리 아 게놈 임산부-상속, 각 셀 내에서 여러 복사본에 존재 이며 호흡 사슬의 단지1의 필수 구성 요소를 인코딩합니다. 마찬가지로 세균성 게놈을 핵 게놈 달리 미토 콘 드리 아 게놈은 구성 수많은 2 차 및 3 차 구조에와 같은 코일 및 supercoiled 구조2는 렌더링할 수 액세스 어려운 시퀀싱 중에 실험3.
핵에서 DNA의 메 틸 화는 유전자 발현의 규칙에 특히 수많은 프로세스에서 역할을 광범위 하 게 공부 epigenetic 표시입니다. 포유류 게놈에서 DNA 메 틸 화는 CG 디 (CpG)에 주로 deoxycytidines의 pyrimidine 링의 5 위치에 주로 발생합니다. 시 토 신 메 틸 화 DNA 기초4체세포와 총의 ~ 1 %의 게놈에서 모든 소비재의 70%에서 발견 된다. DNA methylations CpA, CpT, CpC 등 소비재가 아닌 상황에도 설명 되어 및 배아 줄기 세포5,,67에 모든 methylated cytosines의 25% 까지의 값으로 핵 DNA에 다양 한 금액에 존재.
시 토 신 메 틸 화는 핵 게놈의 널리 인정 하는 동안 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 존재가 여전히 논란. 첫 번째 연구 조사 mtDNA 메 틸 핵 DNA8에 비해 낮은 수준에 있지만 mtDNA 메 틸 화는 쉽게 탐지는, 경작된 한 세포에 수행 되었다. 인간과 murine 셀에서 mtDNA 메 틸 또한 낮은 수준 (2-5%)에서 발견 되었다. 갠 DNA immunoprecipitation (MeDIP) 뒤에 양이 많은 PCR 등 5 methylcytosine 캡처에 의존 하는 분석 실험을 사용 하 여, mtDNA 메 틸 화 다양 한 마우스와 인간에서 또한 검색 되었습니다 및 셀 라인9,10, 11,12. ELISA 분석 결과 또는 질량 분석 5-methylcytosine에 대 한 항 체를 사용 하 여, DNA 메 틸 화 상당한 수준의 순화 된 미토 콘 드리 아 분수13,,1415, 에서 발견 되었습니다. 그러나 16., 상기 연구에서 분석의 대부분 단일 기본 해상도에서 DNA 메 틸 화의 절대 정량화를 제공 하기 위해 설계 되지 않은 기술을 사용.
양적 및 resolutive DNA 메 틸 화 분석 단일 가닥 DNA 컨텍스트17 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 이용 하는 “황산 시퀀싱”, 라는 기술에 의해 달성 될 수 있다 . 황산 시퀀싱에 사용 하 여, 연구의 별자리 시 토 신 메 틸 화 다양 한 수준에서의 존재를 감지 했습니다. D 루프 영역, 12S는 또는 16 지역에서 메 틸 화 mtDNA 인간18,19,20,21,,2223 와 마우스24 에서 쉽게 검색 되었습니다. 그러나 조직 및 세포,, 연구에 걸쳐 총 cytosines의 1-20%의 흥미로운 다양성으로.
이러한 수많은 연구에 비해 단지 몇 가지 연구, 우리의 그룹에서 mtDNA 메 틸3,25,,2627 의 존재를 제기 했거나 심문의 생물학 관련성 mtDNA (2%) 아래 레벨28의 매우 낮은 수준. 최근, 우리는 전체 미토 콘 드리 아 황산 시퀀싱3에서 잠재적인 황산 시퀀싱 아티팩트 관측을 했다. 우리는 메 틸 화 레벨을과 대 평가 함으로써 미토 콘 드리 아 DNA의 이차 구조는 황산 시퀀싱에서 false로 되었다면 이어질 수 있는 증거 제공. 여기 mtDNA의 황산-변환의 아티팩트를 방지 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜 사용 하 여 DNA의 간단한 효소 소화 mtDNA 보조 구조 발생 하 고 황산 황산 시퀀싱 프로토콜을 다음에 대 한 전체 액세스를 허용. 또한, 우리는 황산 시퀀싱의 분석에 대 한 동반 bioinformatic 파이프라인을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 mtDNA 메 틸 화를 심문 하도록 특별히 설계 된 황산 시퀀싱 프로토콜을 제공 합니다. Genomic DNA에 사용 되는 황산-시퀀싱 프로토콜 차이 NUMT 시퀀스에서 거짓 긍정적인 발생 밖으로 지배 이전 금지 효소 소화 단계 및 bioinformatic 분석의 활용에 있다.
우리는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 황산 시퀀싱 아티팩트를 피하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 가양성을 선도 하는 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
노 보 Nordisk 기초 센터 기본 대사 연구를 위한 Novo Nordisk 기초에서 제한 없는 기부금에 의해 부분적으로 투자 코펜하겐 대학에서 독립적인 연구 센터입니다.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
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