Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para permitir la cuantificación exacta de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial. En este protocolo, describimos una digestión enzimática del ADN con BamHI juntada con una tubería de análisis bioinformáticos que se puede utilizar para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación de mtDNA causada por la estructura secundaria del ADNmt.
Abstract
Cuantificación de la metilación del ADN puede lograrse utilizando secuenciación de bisulfito, que aprovecha la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo, en un contexto de ADN monocatenario. Secuenciación de bisulfito puede ser dirigida (mediante PCR) o en todo el genoma y proporciona la cuantificación absoluta de la metilación de la citosina en la sola base-resolución. Dada la naturaleza distinta del ADN nuclear y mitocondrial, en particular en la estructura secundaria, deben realizarse adaptaciones de métodos de secuenciación de bisulfito para la investigación de metilación de citosina en el ADNmt. Estructura secundaria y terciaria del mtDNA puede de hecho conducir a bisulfito de secuenciación artefactos llevando a falsos positivos debido a la deficiente acceso desnaturalización incompleta de bisulfito a ADN monocatenario. Aquí, describimos un protocolo con una digestión enzimática del ADN BamHI juntada con tubería de análisis bioinformáticos para permitir la cuantificación exacta de la citosina niveles de metilación en el ADNmt. Además, proporcionamos las pautas para el diseño de los cebadores de secuencia de bisulfito específicos de mtDNA, para evitar dirigidos a segmentos NUclear mitocondrial indeseables (NUMTs) insertan en el genoma nuclear.
Introduction
El genoma mitocondrial es una estructura circular, doble cadena de aproximadamente 16,5 kilos base (kb), lo que constituye de un pesado y un filamento de la luz. El genoma mitocondrial está presente en múltiples copias en cada célula, maternal heredado y codifica componentes esenciales de la cadena respiratoria complejos1. Similar a los genomas bacterianos y a diferencia del genoma nuclear, el genoma mitocondrial se organiza en numerosas estructuras secundarias y terciarias, como en las estructuras en espiral y superenrollado2, que puede hacer que acceso difícil durante la secuencia experimentos3.
En el núcleo, la metilación del ADN es una marca epigenética ampliamente estudiada que interviene en numerosos procesos, en particular en la regulación de la expresión génica. En genomas mamíferos, la metilación del ADN ocurre principalmente en la posición 5 del anillo de pirimidina de deoxycytidines, sobre todo en los dinucleótidos CG (o CpG). Metilación de la citosina se encuentra en el 70% de los CpG en el genoma de las células somáticas y ~ 1% del total que bases de ADN4. Metilaciones del ADN se ha descrito también en contextos no-CpG, CpC, CpA y CpT y existen en cantidades diferentes en el ADN nuclear, con valores de hasta un 25% de todos los cytosines metilados en células madre embrionarias5,6,7.
Mientras que la metilación de la citosina del genoma nuclear es ampliamente aceptada, la existencia de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial es aún controversial. La metilación de mtDNA investigadora primer estudio fue realizada en células cultivadas donde mtDNA metilación fue detectada fácilmente, aunque en niveles más bajos en comparación con el ADN nuclear8. En las células humanas y murinas, metilación del mtDNA también fue detectada en niveles bajos (2-5%). Usando análisis basándose en 5 METILCITOSINA captura como inmunoprecipitación de ADN metilada (MeDIP) seguida de PCR cuantitativa, metilación del mtDNA también fue detectada en varios ratón y humanos y células líneas9,10, 11,12. Usando los anticuerpos contra 5-METILCITOSINA en un ensayo ELISA o espectrometría de masas, niveles considerables de metilación del ADN fueron detectados de fracciones purificadas mitocondriales13,14,15, 16. sin embargo, la mayoría de los ensayos en los estudios antes mencionados utiliza técnicas que no fueron diseñadas para proporcionar la cuantificación absoluta de la metilación del ADN en la sola resolución de base.
Análisis de metilación de DNA cuantitativo y resolutivo puede lograrse mediante una técnica llamada “bisulfito de secuenciación”, que se aprovecha de la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo en single-stranded DNA contexto17 . Mediante secuenciación de bisulfito, una constelación de estudios ha detectado la presencia de metilación de citosina en los distintos niveles. MtDNA de la metilación de la región D-loop, el 12S o la región 16S fue detectado fácilmente en humanos18,19,20,21,22,23 y ratón24 tejidos y células, sin embargo, con una variabilidad intrigante, de 1-20% del total cytosines en estudios.
En comparación con estos numerosos estudios, sólo unos pocos estudios, como de nuestro grupo, han disputado la presencia de mtDNA metilación3,25,26,27 o cuestionado la importancia biológica de niveles muy bajos de mtDNA (por debajo de 2%)28. Recientemente, informó de la observación de un artefacto de bisulfito de-secuencias posibles en todo mitocondrial bisulfito secuencia3. Proporcionamos evidencia que la estructura secundaria del ADN mitocondrial podría dar lugar a falsos positivos en secuenciación de bisulfito, así sobreestimar los niveles de metilación. Aquí proporcionamos un protocolo para evitar que un artefacto de bisulfito-conversión del ADNmt. Este protocolo utiliza una simple digestión enzimática del ADN para desarticular estructuras secundarias de mtDNA y permitir un acceso completo a siguiendo un protocolo de secuencia de bisulfito bisulfito. Además, ofrecemos un acompañamiento pipeline bioinformática para el análisis de secuenciación de bisulfito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos un protocolo de secuenciación del bisulfito que está específicamente diseñado para interrogar a metilación del mtDNA. Las diferencias con la secuenciación del bisulfito de protocolos utilizados para la extracción de ADN genómico se encuentra en la utilización de un paso de digestión de la enzima de la restricción anterior y un análisis Bioinformático predominante hacia fuera falso positivo derivados NUMT secuencias.
Proporcionamos un protocolo para evitar artefactos de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Novo Nordisk Fundación Centro para la investigación metabólica básica es un centro independiente de investigación en la Universidad de Copenhague, parcialmente financiado por una donación sin restricciones de la Fundación de Novo Nordisk.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
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