Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken
Summary
Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.
Abstract
Eencellige analyse is een belangrijk instrument voor het ontleden van heterogene populaties van cellen. De identificatie en de isolatie van zeldzame cellen kunnen moeilijk zijn. Om te overwinnen deze uitdaging, een methodologie combineren geïndexeerd stroom cytometry en high-throughput multiplexed kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) werd ontwikkeld. Het doel was om te identificeren en te karakteriseren simian immunodeficiëntie virus (SIV)-geïnfecteerde cellen aanwezig binnen rhesus makaken. Via de kwantificatie van oppervlakte-proteïne door fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en mRNA door qPCR, worden virus-geïnfecteerde cellen geïdentificeerd door virale genexpressie, die wordt gecombineerd met host gen- en eiwit metingen een multidimensionale profiel maken . We noemen de aanpak, gerichte eencellige Proteo-transcriptionele evaluatie of tSCEPTRE. Voor het uitvoeren van de methode, zijn levensvatbare cellen gekleurd met fluorescerende antilichamen specifiek voor oppervlakte markeringen gebruikt voor FACS isolatie van een deelverzameling van de cel en/of downstream fenotypische analyse. Afzonderlijke cellen worden gevolgd door onmiddellijke lysis, multiplex omgekeerde transcriptie (RT), pre PCR versterking en hoge doorvoer qPCR van maximaal 96 afschriften gesorteerd. FACS metingen worden geregistreerd op het moment van het sorteren en vervolgens gekoppeld aan het gen expressie gegevens door goed positie om een gecombineerde eiwit en transcriptionele profiel te maken. Om te studeren SIV-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo, cellen werden geïdentificeerd door qPCR detectie van meerdere virale RNA-soorten. De combinatie van virale afschriften en de hoeveelheid van elk bieden een kader voor de indeling van cellen in verschillende fasen van de virale levenscyclus (b.v., productieve versus niet-productieve). Bovendien waren de tSCEPTRE van SIV+ cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen geïsoleerd van het zelfde model host differentially uitgedrukte genen en eiwitten te beoordelen. Uit het onderzoek bleek eerder ongewaardeerd virale RNA expressie heterogeniteit onder geïnfecteerde cellen, alsmede in vivo SIV-gemedieerde post-transcriptional genregulatie met eencellige resolutie. De tSCEPTRE methode is relevant voor de analyse van iedere cel bevolking vatbaar voor identificatie door expressie van oppervlakte-proteïne marker(s), host of pathogen gene(s) of combinaties daarvan.
Introduction
Vele intracellulaire pathogenen rekenen op gastheer cel machines te repliceren, vaak veranderen van de biologie van de cel van de host of gericht op zeer specifieke subpopulaties van cellen van de gastheer te maximaliseren van hun kansen op vermeerdering. Cel biologische processen zijn daardoor vaak verstoord, met schadelijke gevolgen voor de algehele gezondheid van de gastheer. Begrijpen van de interacties tussen virussen en de cellen van de gastheer waarin ze repliceren zal toelichten ziekte mechanismen die bij de ontwikkeling van verbeterde therapieën en strategieën helpen kunnen om infectie te voorkomen. Directe analytische hulpmiddelen waarmee de studie van gastheer-pathogeen interacties zijn essentieel aan dit einde. Eencellige analyse biedt het enige middel ondubbelzinnig een cellulaire fenotype toeschrijven aan een bepaald genotype of infectie status1. Bijvoorbeeld, veroorzaken pathogene infecties vaak zowel directe als indirecte veranderingen in de cellen van de gastheer. Daarom onderscheid te maken geïnfecteerde cellen van hun niet-geïnfecteerde tegenhangers is noodzakelijk om te host cel kenmerkwijzigingen directe infectie of secundaire effecten, zoals veralgemeende ontsteking. Bovendien, voor veel ziekteverwekkers, zoals SIV en human immunodeficiency virus (HIV), host cel infectie verloopt via meerdere fasen, zoals vroeg, laat of latent, elk waarvan kan worden gekenmerkt door verschillende gen- en eiwit expressie profielen2 , 3 , 4 , 5. bulk analyses van cel mengsels te vangen deze heterogeniteit6zal mislukken. Daarentegen zeer multiplexed eencellige analyses kunnen kwantificeren van de expressie van zowel virale en host genen bieden een middel om op te lossen infectie-specifieke cellulaire verstoringen, met inbegrip van variaties in stadia van de infectie. Verder, gastheer-pathogeen interacties in fysiologisch analyseren relevante instellingen is van cruciaal belang voor de identificatie van gebeurtenissen die zich in besmette organismen voordoen. Dus, methoden die kunnen worden toegepast direct ex vivo zijn waarschijnlijk beste vastleggen in vivo verwerkt.
SIV en HIV gericht CD4+ T cellen, waarin ze tegen gastheer antivirale “beperking” factoren en downregulate antigeen presentatie van moleculen te stellen productieve infectie voorkomen immuun toezicht7,8, 9,10,11. Zonder behandeling, de infectie resulteert in massale verlies van CD4+ T-cellen, uiteindelijk culminerend in verworven immunodeficiency syndrome (AIDS)12. In de omgeving van antiretrovirale therapie aanhouden latent geïnfecteerde cel reservoirs voor decennia, een geduchte barrière voor curatieve strategieën poseren. Inzicht in de eigenschappen van in vivo HIV/SIV-geïnfecteerde cellen heeft het potentieel om het onthullen van de ontvangende cel functies instrumentale in de pathogenese en volharding. Echter, dit heeft zijn zeer uitdagend, voornamelijk te wijten aan de low frequency van geïnfecteerde cellen en gebrek aan reagentia kunnen gemakkelijk om ze te identificeren. Cellen die viraal RNA, transcriberen naar schatting aanwezig zijn op 0,01 – 1% van CD4+ T cellen in bloed en lymfoïde weefsel13,14,15. Onder onderdrukkende therapie zijn latent geïnfecteerde cellen zelfs minder frequent op 10-3–10-7 16,17,18. Virale eiwit kleuring testen zijn werk goed voor het bestuderen van in vitro infecties, zoals intracellulaire Gag, suboptimaal is toe te schrijven aan de achtergrondkleuring van 0.01-0,1%, gelijk aan of groter is dan de frequentie van de geïnfecteerde cellen13, 14. Oppervlakte kleuring voor Env eiwit met goed gekarakteriseerd SIV/HIV Env-specifieke monoklonale antilichamen ook bewezen moeilijk te zijn, waarschijnlijk om dezelfde redenen. Onlangs, roman tools willen verbeteren van de opsporing van cellen uiten Gag door hetzij integratie testen specifiek voor gag RNA of met behulp van alternatieve imaging technologieën14,15,19. Een dergelijke aanpak blijven echter beperkt in het aantal kwantitatieve metingen uitgevoerd op elke cel.
Hier beschrijven we een methodologie waarmee (1) enige virus-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo door gevoelige en specifieke virale gen kwantitatieve qPCR en (2) kwantificeert de expressie van maximaal 18 oppervlakte-eiwitten en 96 genen voor elk besmet (en niet-geïnfecteerde) cel. Deze methodologie combineert eencellige oppervlakte-proteïne meting door FACS gevolgd door onmiddellijke cellysis en gebruik van gen expressie analyse multiplexed gerichte qPCR op het Biomark-systeem. De geïntegreerde fluidic circuit (IFC)-technologie kunnen multiplexed kwantificatie van 96 genen van 96 monsters tegelijk, bereikt door een matrix van 9,216 kamers waarin de individuele qPCR reacties worden uitgevoerd. Hoge-inhoud eiwit overvloed metingen de levende cel FACS sortering registreert terwijl het behoud van de volledige transcriptoom p.a. onmiddellijk uitgevoerd stroomafwaarts. Ter identificatie van virus-geïnfecteerde cellen, tests specifiek voor alternatief afgesplitste en unspliced virale RNAs (vRNA) zijn opgenomen in de analyse van de qPCR, samen met een panel van gebruiker gedefinieerde tests tot 96 genen, het maximum aantal testen momenteel ondergebracht in totaal de IFC. De expressie van genen en eiwitten informatie verzameld voor elke cel zijn verbonden door goed standpunt. Eerder berichtten we resultaten van deze analyse elders20. Wij bieden hier, nadere methodologische richtsnoeren, alsmede verdere beschrijvende fenotypering van SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen.
Deze aanpak, die we tSCEPTRE noemen, kan worden toegepast op de schorsingen van een levensvatbare cellen bevolking reactieve fluorescently gelabelde antilichamen en uiten van een transcriptome compatibel met beschikbaar qPCR testen. Bijvoorbeeld kan het worden gebruikt voor het karakteriseren van differentiële gen- en eiwit expressie in zeldzame cellen of cellen niet gemakkelijk kunnen onderscheiden door oppervlakte-proteïne markeringen. De bereiding van de monsters is gebaseerd op een standaard protocol met verkrijgbare antilichamen kleuring. Cytometers met eencellige Sorterende vermogen ook commercieel beschikbaar zijn, maar extra bioveiligheid voorzorgsmaatregelen zijn vereist voor de verwerking van besmettelijke levende cellen. Opnemen van de single – cel eiwit expressie profiel voor elke cel door goed standpunt, aangeduid is als geïndexeerd sorteren, een gemeenschappelijk kenmerk van verkrijgbare FACS sorteren software. Computationele analyse van host differentially uitgedrukte genen onder mobiele bevolkingsgroepen van belang hier niet wordt beschreven, maar verwijzingen naar eerder gepubliceerde methoden worden geleverd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier beschreven, genoemd tSCEPTRE, eencellige oppervlakte-proteïne kwantificatie integreert door multiparameter stroom cytometry met kwantitatieve eencellige mRNA uitdrukking door zeer multiplexed RT-qPCR. De vereniging van deze twee technologieën kunt momentopnamen van hoge-inhoud van de gecombineerde transcriptionele en eiwit Profiel van afzonderlijke cellen in de indeling van een hoge gegevensdoorvoer. Wij gebruiken de methode voorheen ongrijpbare cellen geïnfecteerd met SIV in vivoopsporen, e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank de NIAID VRC Stroom Cytometry kern en de MHRP Stroom Cytometry Core voorzieningen voor onderhoud en werking van FACS instrumenten en sorteermachines; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song voor deskundige technische bijstand; Michael Piatak, Jr. (overleden) voor hulp bij SIV ontwerp voor de bepaling van de qPCR; en Brandon Keele en Matthew Scarlotta voor SIV isoleren sequenties. De standpunten zijn die van de auteurs en mag niet worden uitgelegd te vertegenwoordigen de standpunten van het Amerikaanse leger of het ministerie van defensie. Onderzoek werd uitgevoerd onder een protocol van de goedgekeurde dierlijke gebruik in een AAALAC geaccrediteerde faciliteit met inachtneming van de Animal Welfare Act, federale statuten en andere voorschriften met betrekking tot dieren en experimenten waarbij dieren en houdt zich aan de beginselen vermeld in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NRC publicatie 2011 editie.
Materials
|
RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
|
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
|
Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
|
Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
|
MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
|
DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
|
Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
|
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
|
SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
|
Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
|
dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
|
ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
|
DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
|
RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
|
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
|
CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
|
TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
|
Biomark reagents |
|||
|
Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
|
TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
|
Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
|
Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
|
Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
|
FACS reagents |
|||
|
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
|
CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
|
5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
|
Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
|
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
|
Instruments |
|||
|
BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
|
BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
|
ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
|
Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
Riferimenti
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
