Här presenterar vi ett protokoll för antikropp matriser för att identifiera förändringar i signalvägar i olika cellular-modeller. Dessa förändringar kan orsakas av läkemedel/hypoxi/ultra-violet ljus/strålning, eller överuttryck/nedreglering/knockouts, är viktiga för olika sjukdomsmodeller och kan indikera om en terapi blir effektivt eller kan identifiera mekanismer av droger motstånd.
Patienter med en avvikande reglering av protein fosforylering näten behandlas ofta med tyrosinkinashämmare. Svarsfrekvenser närmar sig 85% är vanliga. Tyvärr blir patienter ofta refraktär till behandling genom att ändra deras cellsmedierade reaktioner. En implementering av uttrycket profilering med microarrays kan identifiera förändringarna som övergripande mRNA-nivå, och proteomik kan identifiera de övergripande förändringarna i proteinnivåer eller kan identifiera proteinerna som är inblandade, men aktiviteten av Signaltransduktion vägar kan endast fastställas genom förhör post-translationella modifieringar av proteiner. Som ett resultat, är förmåga att identifiera huruvida en läkemedelsbehandling är lyckad eller om motstånd uppstod, eller förmåga att karakterisera eventuella ändringar i signalvägar, en klinisk utmaning. Här ger vi en utförlig förklaring av antikropp matriser som ett verktyg som kan identifiera systemomfattande ändringar i olika post-translationella modifieringar (t.ex., fosforylering). En av fördelarna med att använda antikropp arrayer innehåller deras tillgänglighet (en matris inte kräver antingen en expert inom proteomik eller dyr utrustning) och hastighet. Tillgången på matriser inriktning en kombination av post-translationella modifieringar är den primära begränsningen. Dessutom kanske opartiska metoder (phosphoproteomics) mer lämplig för roman upptäckten, medan antikropp matriser är idealiska för de mest kännetecknas mål.
Det kliniska genomförandet av de riktade tyrosinkinashämmare (TKI) har förvandlat cancerbehandling genom att tillhandahålla läkare med effektiva verktyg för att rikta specifika proteinerna att driva neoplastisk transformation. Dessa föreningar hämma eller blockera fosforyleringen av proteiner riktade av tyrosin kinaser1,2. TKI utvecklades delvis eftersom genetiska förändringar i olika nyckel signalering gener är tillräckliga för att driva cancer initiering och progression [e.g., epidermal tillväxtfaktor (EGFR), proto-onkogener tyrosin-proteinkinas Src (SRC), BCR-ABL och human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2)]3,4. Inverkan av TKI på cell cykeln5 och molekylär signalering vägar6 representerar en omvandling från de oriktade till molekylärt guidade cancerbehandlingen. Den viktigaste fördelen med TKI jämfört med kemoterapi är de ökad svarsfrekvenserna och den lägre risken för toxicitet till friska celler7. Som ett resultat, det har varit att öka uppmärksamhet på forskning och utveckling av nya TKI.
Tillgång till genomisk sekvensering resultaten började med Human Genome Project8,9,10 och fortsätter idag med olika nästa generation (NextGen) cancer sekvensering ansträngningar [e.g., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Detta har inspirerat många experimentella metoder som ger samtidig information om tusentals gener och/eller ge opartisk ögonblicksbilder av gener eller proteiner som moduleras av biologiska störningar13. Eftersom regleringen av cellulära funktionen sker på flera nivåer, från transkriptionen av gener den posttranslationella modifieringen av proteiner och deras verksamhet, kommer en fullständig förståelse av de händelser som styr cellulära funktionen Slutligen kräver en integration av data från olika biologiska utläsningar. Möjlighet att övervaka budbärar-RNA (mRNA) nivåerna av tusentals gener med en enskild cell gene upplösning har ökat förmågan att göra slutledningar om geners funktion och interaktioner i helgenom-skala. Dock tolkningen av gene expression arrays kommer alltid att vara inneboende ofullständig utan integration av andra nivåer av förordning: nämligen protein uttryck nivåer protein modifiering staterna och proteinet posttranslationella ändringar (fosforylering, ubiquitin, metylering, etc.). Här, beskriver vi verktyget antikropp-matriser som medel att förhöra post-translationella modifieringar av viktiga signalering komponenter som en funktion av olika villkor i en enda experiment14,15, 16.
Phospho-antikropp matriser kan användas för att urskilja och analysera förändringar i signaltransduktion vägar16. Dessa kan uppstå från en genetisk modifiering eller behandlingar av cellinjer med kinashämmare, kemoterapeutika, stress orsakad av glukos deprivation, hypoxi eller serum svält. Obs, resistens eller en specifik gen kan upp- eller nedreglering också orsaka förändringar i signaltransduktion vägar17.
Läkemedelsresistens, kan exempelvis uppstå mutationer av drogen målet att undvika känslighet. I lungcancer, kända EGFR-mutationer återge cancer mottaglig till vissa TKI, men mer mottagliga för andra. Alternativ signalering vägar kan aktiveras vid mutation17. Phospho-antikropp matriser ger mer insikt om som ett bredare program för identifiering av de cellsmedierade reaktioner deltar i motstånd och hypoxi, etc., och följaktligen förståelse av, mekanismerna involverade.
Teknik som möjliggör en bedömning av protein ändringar utgör en viktig komponent i systembiologi eftersom de tjänar ofta en reglerande funktion, såsom modulera aktiviteten hos ett enzym eller fysiska interaktioner mellan proteiner. Vikten av post-translationella modifieringar illustreras av rollen av protein fosforylering i nästan alla extracellulära-utlöst signaltransduktion vägar18. Traditionellt, kan identifiering av kinaser eller phosphorylation status av proteiner också bestämmas genom Western blot analys, särskilt om forskaren är intresserad av endast 1 – 5 mål. Dock Western blotting är mycket selektiva och kan vara partisk mot förkunskaper och kan missa viktiga mål som ett resultat. Antikropp array(s) ger en medium-genomströmning avläsning av flera mål genom att bädda in olika capture-antikroppar [pan-specifika fosforylerade tyrosine(s), anti-ubiquitin, etc.] på en solid matris(t exglas eller nitrocellulosa). Sekundära antikroppar ger information om specifika proteiner i en sandwich-baserade ELISA-format (figur 1). Denna analys blir mer kraftfull och relevant som mer mål är av intresse eller tidigare kunskap är begränsad15. De phospho-arrayer är mer allmänt anställningsbara som de kan jämföra fosforylering samt allmänna mängder protein av ett bredare utbud av mål i ett experiment och ger en betydligt bättre kvantifiering över masspektrometri. Denna teknik är inte tillämplig för identifiering av nya eller tidigare okända fosforylering platser.
Storskaliga mass spectrometry-baserad proteomik kunde användas för att identifiera specifika fosforylering områden av proteiner19. Även om denna teknik kan räkna upp tusentals posttranslationella händelser, kräver det dyra instrumentering, dedikerad experimentella rörledningar och en computational sakkunskap som är utom räckhåll för de flesta forskare.
Antikropp matriser ger en samtidig avläsning på olika protein utläsningar16. Dessa kan vara förändringar i protein ubiquitin (ubiquitin matris) eller fosforylering. Den viktigaste fördelen med denna array-teknik är att det ger viktig feedback på biologiska tillståndet för olika biologiska spridningsvägar är associerad med viktig cell parametrar (protein 53 kDa, p53, receptortyrosinkinaser och sockernivån) samtidigt. Dessutom är det möjligt att kombinera olika matristyper för att öka penetrationen av ett test (t.ex., apoptos och ubiquitin och fosforylering). Denna förmåga att kombinera flera matriser för att bedöma olika posttranslationella förändringar i flera prover samtidigt på en tid och cost effective sätt som inte kräver specifik instrumentering eller expertis är av en betydande fördel i fall antikropp-matriser.
Strategier som kombinerar många biologiska utläsningar är till sin natur mer exakt representationer av det cellulära maskineriet i ett experiment som utförs. Tillkomsten av phospho-antikropp matriser gör en snabb karakterisering av mönstret för ändringar som kan vara mer informativa än ändring status för någon enda protein. Det allmänna arbetsflödet för tillämpningen av phospho-antikropp matriser är baserad på en ändring i serine, treonin eller tyrosin. Detta exempel fokuserat på karakterisera de fö…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för generöst ekonomiskt stöd av Lawrence J. Ellison Institute of omvälvande Medicine av USC (en gåva till David Agus). Vi uppskattar stöd av hösten Beemer och Lisa Flashner som leder till generation och offentliggörandet av detta manuskript. Vi tackar Laura Ng för hennes administrativt stöd.
Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
1.5 ml tube | Eppendorf | 22363212 | |
Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
Tissue Culture dish 100mm | TRP | 93100 | |
ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27G5/8, 1ml for needle treatment of protein samples |
Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher | 78446 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |