Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique
Summary
Nous décrivons ici une approche protéomique unicellulaires Evaluer immunitaire phénotypique et fonctionnelle (induction de cytokines intracellulaires) des altérations dans les échantillons de sang périphérique, analysés par cytométrie en masse.
Abstract
Cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse des maladies auto-immunes. Par conséquent, la mesure des niveaux de cytokine a fait l’objet de plusieurs études pour tenter de comprendre les mécanismes précis qui conduisent à la rupture de l’autotolérance et l’auto-immunité ultérieure. Les approches jusqu’ici ont été fondées sur l’étude d’un aspect spécifique du système immunitaire (un seul ou quelques types de cellules ou de cytokines) et n’offrent pas une évaluation globale d’une maladie auto-immune complexe. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés. Une approche globale de la cellule unique pour évaluer la production de cytokines en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, dans le cadre de « intrinsèque » spécifique au patient plasmatique circulant des facteurs, est décrite ici. Cette approche permet la surveillance du phénotype immunitaire spécifique au patient (marqueurs de surface) et fonction (cytokines), soit dans son indigène » intrinsèque pathogènes » maladie, État, ou en présence d’agents thérapeutiques (in vivo ou ex vivo).
Introduction
Les maladies auto-immunes sont une cause majeure de morbidité et de mortalité touchant 3-8 % de la population. Aux États-Unis, les maladies auto-immunes sont parmi les principales causes de décès chez les femmes jeunes et d’âge moyen (âges < 65 ans)1,2. Maladies auto-immunes sont caractérisées par une présentation clinique hétérogène et divers processus immunologiques sous-jacents. Le spectre de l’hétérogénéité est bien représenté à travers différents troubles, comme articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) et les maladies neurologiques dans la sclérose en plaques (MS). Toutefois, ce niveau d’hétérogénéité est également illustré dans un trouble unique, comme le lupus érythémateux systémique (les) : certains patients peuvent présenter des pathologie rénale, alors que d’autres souffrent de participation hématologique ou mixte3.
L’immunopathogenèse sous-jacente dans les maladies auto-immunes reflète l’hétérogénéité clinique, impliquant et hyper-activation automatique de plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative et la production de cytokines dysrégulation concomitante. Alors que les cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie auto-immune, comprendre leur rôle spécifique dans le mécanisme de la maladie s’est avéré difficile. Cytokines sont caractérisés par la pléiotropie (une cytokine peut avoir des effets multiples sur différents types de cellules), redondance (cytokines multiples peuvent avoir le même effet), la dualité (une cytokine peut avoir des effets pro – ou anti-inflammatoires, dans des conditions différentes), et la plasticité (cytokines peut être moulé dans un rôle différent de son « original », selon l’environnement)4,5,6. Par conséquent, méthodes l’échelle de la population ne peut pas distinguer les réponses cellulaires hétérogènes à la même « milieu de cytokine ». De même, les plans d’études qui mettent l’accent sur un aspect spécifique du système immunitaire (cellules du même type ou cytokine), n’offrent pas une évaluation globale de tous les éléments impliqués dans des maladies auto-immunes complexes. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés.
Récemment, nous avons développé une approche protéomique monocellulaires pour évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Le workflow décrit ici est caractérisé par l’utilisation d’échantillons de sang périphérique intacte, par opposition aux cellules mononucléaires isolées du sang périphérique (PBMC). Sang périphérique représente le véhicule plus physiologiquement pertinent pour étudier la maladie auto-immune systémique, incluant 1) non-sang des mononucléaires souvent impliqués dans les maladies auto-immunes (p. ex., neutrophiles, plaquettes) et le plasma 2) circulant de facteurs, tels que les acides nucléiques, complexes immuns et cytokines, qui ont un rôle activateur immunitaire. Pour capturer le « intrinsèque pathogènes » dysrégulation la production de cytokines, les échantillons sont traités immédiatement après le tirage de sang (T0, temps zéro) et après 6 h d’incubation à 37 ° C (température du corps physiologique) avec un transport des protéines du sang périphérique inhibiteur en l’absence de toute condition de stimulation exogène (T6, durée 6 h), pour détecter la production de cytokines (accumulation, T6-T0) qui reflète l’état de la maladie « intrinsèque » (Figure 1). Pour étudier les processus de dysrégulation qui reflètent plus ou moins activation des voies de signalisation impliquées dans les réponses immunitaires pertinents à la maladie, des échantillons de sang périphérique sont traités (6 h d’incubation à 37 ° C avec un inhibiteur de transport de protéine) avec une exogène stimuler la condition qui reflète la pathogenèse de la maladie, tels que les agonistes des récepteurs Toll-Like (TLR) dans le cas de SLE (T6 + R848, temps de 6 h avec 1 µg/mL R848), pour détecter la production de cytokines qui refléterait une réponse aux acides nucléiques (comparant T0 vs T6 vs T6 + R848, Figure 1). Afin d’étudier les effets immunomodulateurs de thérapeutique disponible ex vivo, en ce qui concerne les processus précis dysrégulation immunitaire des patients spécifiques, des échantillons de sang périphérique sont traitées par un inhibiteur JAK à la thérapeutique concentration (ici, 5 uM ruxolitinib ; T6 + 5R, temps de 6 h avec 5 uM ruxolitinib), pour détecter des changements dans l’état de la maladie « intrinsèque » en réponse à la drogue (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figure 1). Un inhibiteur JAK a été choisi pour cette étude parce que les inhibiteurs de JAK auraient dû être divulgués pour réussir dans le traitement de maladies auto-immunes telles que RA
Evaluer simultanément les dysrégulation des processus décrits ci-dessus en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, des échantillons de sang périphérique de SLE patients et témoins sains ont été traitées comme décrit ci-dessus et analysés par cytométrie de flux massique. Cytométrie en masse, également connu sous le nom Cytometry-Time-Of-Flight, offre une analyse unicellulaires de plus de 40 paramètres sans problèmes de spectral chevauchent7,8,9. Cette technique utilise des isotopes métalliques de terres rares sous forme d’ions métalliques solubles sous forme de balises liés aux anticorps, au lieu de fluorophores10. Des détails supplémentaires au sujet de la plateforme technologique de cytométrie de flux massique (c.-à-d., tuning et étalonnage, l’acquisition de l’échantillon) se trouvent dans Leipold et coll. et McCarthy et al. 11 , 12 la haute-dimensionnalité de cytométrie de flux massique permet mesure simultanée de plusieurs cytokines dans l’ensemble des sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative avec granularité unicellulaires (Table des matières).
Les paramètres cliniques et de laboratoire classiques actuels ne sont souvent pas sensibles ou suffisamment précis pour détecter l’activité en cours de la maladie ou la réponse aux immunomodulateurs spécifiques13, reflétant la nécessité de mieux délimiter le système immunitaire sous-jacent changements qui animent les poussées. Compte tenu de l’omniprésence de dérèglement de cytokine dans une maladie auto-immune, une multitude de méthodes de traitement qui utilisent des anticorps ou des petits inhibiteurs moléculaires ciblant les cytokines ou la signalisation des protéines impliquées dans la régulation de la production de cytokines ont récemment vu le jour. Dans son format de base, l’approche analytique de sang périphérique décrite ici fournit une plate-forme pour identifier les sous-ensembles de cellules spécifiques au patient dysrégulation et leur production de cytokines anormale dans une maladie auto-immune avec des manifestations systémiques. Cette méthodologie permet la personnalisation des choix thérapeutiques comme dysrégulation spécifique cytokines peuvent être identifiés, et un traitement spécifique peut être testé ex vivo pour évaluer leur capacité à immunomodulate la patiente maladie spécifique processus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un roman, unicellulaires, approche protéomique à évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Cette méthode emploie le sang périphérique comme véhicule analytique et masse cytométrie de flux comme outil pour évaluer les anomalies immunitaires cellulaires phénotypiques et fonctionnelles. La méthode est facilemen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Aimee Pugh-Bernard pour son apport intellectuel et commentaires utiles. Ce travail est soutenu par le nombre Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award et prix K23-1K23AR070897 du NIH à Elena W.Y. Hsieh. Elle est également soutenue par attribution numéro K12-HD000850 de l’Institut National d’Eunice Kennedy Shriver , de la santé de l’enfant et le développement humain et la Lucile Packard Foundation pour la santé de l’enfant, Stanford CSTC UL1 TR001085 et Child Health Research Institut de Stanford University.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
Riferimenti
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