Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa
Summary
Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.
Abstract
Citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi delle malattie autoimmuni. Quindi, la misurazione dei livelli di citochine è stata al centro di molteplici studi nel tentativo di capire i meccanismi precisi che portano alla rottura della tolleranza al self e autoimmunità successive. Approcci finora sono stati basati sullo studio di un aspetto specifico del sistema immunitario (un singolo o pochi tipi di cellule o citochine) e non offrono una valutazione globale della malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate. Un approccio globale di singola cellula per valutare la produzione di citochina in più sottoinsiemi di cellule immuni, all’interno del contesto di “intrinseco” plasma paziente-specifici fattori, di circolazione è descritto qui. Questo approccio consente il monitoraggio del fenotipo immune paziente-specifici (marcatori di superficie) e funzione (citochine), sia nella sua nativa “intrinseco patogeni” malattia stata, o in presenza di agenti terapeutici (in vivo o ex vivo).
Introduction
Le malattie autoimmuni sono delle principali cause di morbilità e mortalità che colpisce 3-8% della popolazione. Negli Stati Uniti, disordini autoimmuni sono tra le principali cause di morte tra le donne giovani e di mezza età (età < 65 anni)1,2. Disordini autoimmuni sono caratterizzati dalla presentazione clinica eterogenea e diversificati processi immunologici sottostanti. Lo spettro di eterogeneità è ben rappresentato in diversi disturbi, come la partecipazione unita nell’artrite reumatoide (RA) e malattia neurologica nella sclerosi multipla (MS). Tuttavia, questo livello di eterogeneità è esemplificato anche all’interno di un singolo disordine, come il lupus eritematoso sistemico (Les): alcuni pazienti possono presentare con patologia renale, mentre gli altri soffrono di coinvolgimento ematologico o misto3.
Immunopatogenesi sottostante nei disordini autoimmuni rispecchia l’eterogeneità clinica, che coinvolge e iper-attivazione automatica di più sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili e dysregulated concomitante produzione di citochine. Mentre citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi della malattia autoimmune, comprendere il loro ruolo specifico nel meccanismo di malattia ha dimostrato di essere impegnativo. Le citochine sono caratterizzate da pleiotropia (una citochina può avere molteplici effetti su diversi tipi di cellule), ridondanza (citochine multiple possono avere lo stesso effetto), la dualità (una citochina può avere effetti pro – o anti – infiammatori in condizioni diverse), e plasticità (citochine possono essere modellate in un ruolo diverso da quello “originale”, a seconda dell’ambiente)4,5,6. Di conseguenza, metodi a livello di popolazione non possono distinguere le risposte cellulari eterogenee per la stessa “milieu citochinico”. Allo stesso modo, progettazione degli studi che si concentrano su un aspetto specifico del sistema immunitario (una citochina o tipo unicellulare), non offrono una valutazione globale di tutti gli elementi coinvolti nella malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate.
Recentemente, abbiamo sviluppato un approccio di proteomica di singola cellula per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell’ambiente del paziente specifico “patogeni” plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Il flusso di lavoro descritto qui è caratterizzato dall’uso di campioni di sangue intero periferico intatto, al contrario di cellule mononucleari di sangue periferico isolato (PBMCs). Sangue periferico intero rappresenta il veicolo più fisiologicamente rilevante per studiare la malattia immune-mediata sistematica, compreso globuli 1) non-mononucleari spesso coinvolti nella malattia autoimmune (cioè, neutrofili, piastrine) e 2) del plasma circolazione di fattori, quali gli acidi nucleici, i complessi immuni e citochine, che hanno ruoli di attivazione immunitario. Per catturare il “intrinseco patogeni” produzione dysregulated di citochina, sangue periferico campioni vengono elaborati immediatamente dopo il prelievo del sangue (T0, tempo zero) e dopo 6 h di incubazione a 37 ° C (temperatura corporea fisiologica) con un trasporto di proteine inibitore in assenza di qualsiasi condizione di stimolazione esogena (T6, tempo 6 h), per rilevare la produzione di citochine (accumulo, T6-T0) che rifletta lo stato di malattia “intrinseca” (Figura 1). Per studiare processi dysregulated che riflettono sopra o sotto-attivazione di vie di segnalazione coinvolte nelle risposte immunitarie pertinenti alla malattia, campioni di sangue periferici sono trattati (6 ore di incubazione a 37 ° C con un inibitore della proteina di trasporto) con un esogeno stimolando la condizione che riflette la patogenesi della malattia, quali gli agonisti del recettore Toll-Like (TLR) nel caso di SLE (T6 + R848, tempo 6 h con R848 1 µ g/mL), per rilevare la produzione di citochine che riflettesse una risposta agli acidi nucleici (confronto tra T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Per studiare gli effetti immunomodulatori di terapie disponibili ex vivo, come si riferiscono ai processi dysregulated immune preciso per specifici pazienti, campioni di sangue periferici sono trattati con un inibitore JAK alle pertinenti terapeutico concentrazione (qui, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6h con 5 uM ruxolitinib), per rilevare le modifiche nello stato di malattia “intrinseca” in risposta al farmaco (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Un inibitore JAK è stato scelto per questo studio perché gli inibitori JAK sono stati indicati per avere successo nel trattamento di malattie autoimmuni come ra
Per valutare contemporaneamente i processi di dysregulated sopra descritti in più sottoinsiemi di cellule immunitarie, i campioni di sangue periferico da SLE pazienti e controlli sani sono stati trattati come descritto in precedenza e analizzati mediante citometria a massa. Citometria a massa, noto anche come Cytometry-Time-Of-Flight, offre analisi unicellulare di oltre 40 parametri senza problemi di spettrale si sovrappongono7,8,9. Questa tecnica utilizza terre rare isotopi del metallo sotto forma di ioni metallici solubili come tag associato agli anticorpi, invece di fluorofori10. Ulteriori dettagli riguardanti la piattaforma tecnologica di citometria a massa (cioè, tuning e calibrazione, acquisizione di esempio) possono essere trovati in Leipold et al e McCarthy et al. 11 , 12 l’alta-dimensionalità di massa cytometry consente la misura simultanea delle citochine multiple in tutta sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili con granularità di singola cellula (Tabella materiali).
Corrente convenzionale di parametri clinici e di laboratorio spesso non sono sufficientemente specifiche per la rilevazione di attività di malattia in corso o la risposta a specifici immunomodulatori13, che riflette la necessità di delineare meglio il sistema immunitario sottostante o sensibili modifiche che guidano le fiammate. Data la pervasività della citochina disregolazione nella malattia autoimmune, hanno una pletora di approcci terapeutici che utilizzano gli anticorpi o piccoli inibitori molecolari targeting citochine o segnalazione di proteine coinvolte nella regolazione della produzione di citochine recentemente è emerso. Nella sua forma base, l’approccio analitico di sangue periferico qui descritto fornisce una piattaforma per identificare dysregulated paziente-specifici sottoinsiemi di cellule e la loro produzione di citochina anormale nella malattia autoimmune con le manifestazioni sistematiche. Questa metodologia permette per la personalizzazione delle scelte terapeutiche come citochine dysregulated specifici possono essere identificate, trattamento specifico di opzioni possono essere esaminato ex vivo per valutare la loro capacità di immunomodulate il paziente malattia specifica processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un romanzo, unicellulare, approccio proteomico per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell’ambiente del paziente specifico “patogeni” plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Questo metodo utilizza sangue intero periferici come il veicolo analitico e citometria a massa come lo strumento per la valutazione di anomalie fenotipiche e funzionali cellulari immuni. Il metodo è facilmente applicabile a studi umani e topi<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Aimee Pugh-Bernard per suo input intellettuale e utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award e il premio numero K23-1K23AR070897 dal NIH per Elena W.Y. Hsieh. Lei era anche supportata da premio numero K12-HD000850 da Eunice Kennedy Shriver National Institute di salute del bambino e lo sviluppo umano e la Lucile Packard Foundation per la salute dei bambini, Stanford CTSA UL1 TR001085 e ricerca di salute dei bambini Istituto della Stanford University.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
Riferimenti
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