Här beskriver vi en encellig proteomiska metod för att utvärdera immun fenotypiska och funktionell (intracellulära cytokin induktion) förändringar i perifera hela blodprover analyseras via massa flödescytometri.
Cytokiner spelar en nyckelroll i patogenesen för autoimmuna sjukdomar. Mätning av cytokin nivåer har därför varit i fokus för flera studier för att försöka förstå de exakta mekanismer som leder till nedbrytning av self-tolerance och efterföljande autoimmunitet. Metoder hittills har baserats på att studera en viss aspekt av immunförsvaret (en enda eller några celltyper eller cytokiner) och erbjuder inte en helhetsbedömning av komplexa autoimmun sjukdom. Medan patienten sera-baserade studier har gett viktiga insikter i autoimmunitet, ger de inte den specifika cellulära källan av den dysreglerad cytokiner upptäcks. En encellig helhetssyn att utvärdera cytokin produktion i flera immunceller delmängder, inom ramen för ”inneboende” patient-specifika plasma cirkulerar faktorer, beskrivs här. Detta tillvägagångssätt möjliggör övervakning av patientspecifika immun fenotypen (yta markörer) och funktion (cytokiner), antingen i dess infödda ”inneboende patogena” sjukdomen tillstånd, eller i närvaro av terapeutiska medel (i vivo eller ex vivo).
Autoimmuna sjukdomar är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet påverkar 3-8% av befolkningen. I USA, autoimmuna sjukdomar är bland de vanligaste dödsorsakerna bland unga och medelålders kvinnor (åldrar < 65 år)1,2. Autoimmuna sjukdomar kännetecknas av heterogena kliniska presentation och olika underliggande immunologiska processer. Spectrumen av heterogenitet är väl representerad över olika störningar, såsom gemensamma engagemang i reumatoid artrit (RA) och neurologisk sjukdom vid multipel skleros (MS). Emellertid, denna nivå av heterogenitet exemplifieras också inom en enda sjukdom, såsom systemisk lupus erythematosus (SLE): vissa patienter kan uppvisa nedsatt patologi, medan andra lider av hematologiska eller gemensamma engagemang3.
Den underliggande immunpatogenes i autoimmuna sjukdomar speglar den kliniska heterogenitet, som omfattar auto – och hyper-aktivering av flera medfödd och adaptiv immunceller delmängder, och samtidig dysreglerad cytokin produktion. Medan cytokiner spelar en nyckelroll i patogenesen av autoimmun sjukdom, har förstå deras specifika roll i mekanismen för sjukdom visat sig vara utmanande. Cytokiner kännetecknas av pleiotropy (ett cytokin kan ha flera effekter på olika celltyper), redundans (flera cytokiner kan ha samma effekt), dualitet (ett cytokin kan ha pro – eller anti – Anti-Inflammatory effekter under olika förhållanden), och plasticitet (cytokiner kan formas i en roll som skiljer sig från dess ”ursprungliga”, beroende på miljön)4,5,6. Följaktligen kan inte befolkningen nivå metoder skilja heterogena cellulära svar till den samma ”cytokin miljön”. Likaså erbjuder studiedesigner som fokuserar på en specifik aspekt av immunförsvaret (en enda celltyp eller cytokin), inte en helhetsbedömning av alla element som ingår i komplexa autoimmun sjukdom. Medan patienten sera-baserade studier har gett viktiga insikter i autoimmunitet, ger de inte den specifika cellulära källan av den dysreglerad cytokiner upptäcks.
Nyligen har utvecklat vi en encellig proteomiska för att samtidigt bedöma flera immunceller typer, och upptäcka deras olika cytokin-störningar i miljön i särskilda ”patogena” perifer blodplasma cirkulerande patientfaktorer. Arbetsflödet beskrivs här kännetecknas av användning av intakt perifer helblod prover, i motsats till isolerade perifera mononukleära blodceller (PBMC). Perifera helblod representerar mest fysiologiskt relevanta fordonet att studera systemiska immunmedierade sjukdomar, inklusive (1) icke-mononukleära blodkroppar ofta inblandade i autoimmun sjukdom (dvs, neutrofiler, trombocyter), och 2) plasma cirkulerande faktorer, såsom nukleinsyror, immunkomplex och cytokiner, vilka har immun aktiverande roller. Att fånga de ”inneboende patogena” dysreglerad cytokin produktion, perifert blod prover bearbetas omedelbart efter blodprov (T0, tid noll), och efter 6 h inkubation vid 37 ° C (fysiologiska kroppstemperatur) med en proteintransport hämmare i avsaknad av något EXOGEN stimulerande tillstånd (T6, tid 6 h), att upptäcka cytokin produktion (ackumulering, T6-T0) som skulle spegla tillståndet ”inneboende” sjukdom (figur 1). Att studera dysreglerad processer som reflekterar över eller under aktivering av signalering inblandade i immunsvar som är relevanta för sjukdomen, perifert blodprover är behandlade (6 h inkubation vid 37 ° C med ett protein transport hämmare) med en exogen stimulera tillstånd som återspeglar sjukdomspatogenes, såsom Toll-Like-Receptor (TLR)-agonister vid SLE (T6 + R848, tid 6 h med 1 µg/mL R848), för att upptäcka cytokin produktion som skulle återspegla ett svar till nukleinsyror (jämföra T0 vs. T6 vs. T6 + R848, figur 1). För att studera immunmodulerande effekter av tillgängliga therapeutics ex vivo, som de avser exakt immun dysreglerad processerna för specifika patienter, behandlas perifert blodprover med en JAK-hämmare på relevanta terapeutiska koncentration (här, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tid 6 h med 5 uM ruxolitinib), upptäcka förändringar i ”inneboende” sjukdomstillstånd som svar på läkemedlet (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, figur 1). En JAK-hämmare valdes för denna studie eftersom JAK-hämmare har visat sig vara framgångsrik vid behandling av autoimmuna sjukdomar såsom RA.
För att samtidigt bedöma de dysreglerad processer som beskrivs ovan i flera immunceller delmängder, perifert blodprover från SLE var patienter och friska kontroller bearbetas enligt ovan och analyseras av massa flödescytometri. Massa flödescytometri, även känd som flödescytometri-Time-Of-Flight, erbjuder enskild cell analys av över 40 parametrar utan problem av spektral överlappar7,8,9. Denna teknik använder sällsynta jordartsmetaller metall isotoper i form av lösliga metalljoner som Taggar bunden till antikroppar, i stället för fluorophores10. Ytterligare detaljer om den tekniska plattformen för massa flödescytometri (dvs, tuning och kalibrering, provtagning) kan hittas i Leipold et al. och McCarthy et al. 11 , 12 de hög-dimensionerna av massa flödescytometri möjliggör samtidig mätning av flera cytokiner i hela medfödd och adaptiv immunceller undergrupper med encelliga granularitet (Tabell för material).
Nuvarande konventionella kliniska och laboratorie-parametrar är ofta inte känslig eller tillräckligt specifik för att upptäcka pågående sjukdomsaktivitet eller svar på specifika immunomodulatorer13, vilket återspeglar behovet av att bättre avgränsa den underliggande immun förändringar som driver flare-ups. Med tanke på den ökande användningen av cytokin dysreglering vid autoimmun sjukdom, en uppsjö av behandlingsmetoder som använder antikroppar eller små molekylära hämmare inriktning cytokiner eller signalering proteiner involverade i regleringen av cytokin produktion har nyligen uppstått. I dess grundläggande format ger den perifera analytisk metod som beskrivs här en plattform för att identifiera patientspecifika dysreglerad cell underdelar och deras onormala cytokin produktion i autoimmun sjukdom med systemiska manifestationer. Denna metod möjliggör personalisering av terapeutiska alternativ som specifika dysreglerad cytokiner kan identifieras, och specifik behandling alternativ kan vara testade ex vivo att bedöma deras förmåga att immunomodulate patientens specifika sjukdomen processen.
Här beskriver vi en roman, encelliga, proteomiska strategi att samtidigt bedöma flera immun celltyper och upptäcka deras olika cytokin-störningar i miljön i särskilda ”patogena” perifer blodplasma cirkulerande patientfaktorer. Denna metod använder perifera helblod som analytisk fordon och massa flödescytometri som verktyget för utvärdering av immun cellulära fenotypiska och funktionella avvikelser. Metoden är lättillämpliga till människa och möss studier21, och är kompatibel m…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Aimee Pugh-Bernard för hennes intellektuella ingång och hjälpsamma kommentarer. Detta arbete stöds av Boettcher Foundation Webb-Waring biomedicinsk forskning- stipendiet antalet K23-1K23AR070897 från NIH till Elena W.Y. Hsieh. Hon var också stöds av award antal K12-HD000850 från Eunice Kennedy Shriver National Institute barns hälsa och mänskliga utvecklingen och den Lucile Packard Foundation för barnens hälsa, Stanford CTSA UL1 TR001085 och barn hälsoforskning Institutet av Stanford University.
Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
RPMI | Gibco | 21870-076 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies used for Mass Cytometry | |||
Surface markers | |||
CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
Cytokines | |||
IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |