تحديد نوع الخلايا العصبية مع أوبترودي زجاج في الفئران مستيقظا أوبتوجينيتيكس
Summary
ويدخل هذا العمل وسيلة لأداء وحدة-أوبتوجينيتيك واحد تسجيل موثوق من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا.
Abstract
مصدر قلق كبير في علم الأعصاب كيف مختلف أنواع الخلايا العصبية تعمل في الدوائر العصبية. وقد مكنت التقدم الذي أحرز مؤخرا في أوبتوجينيتيكس تحديد نوع الخلايا العصبية في فيفو التجارب الكهربية في مناطق واسعة من الدماغ. في تجارب أوبتوجينيتيكس، أنها حاسمة بالنسبة لإيصال الضوء إلى موقع التسجيل. ومع ذلك، من الصعب غالباً ما يسلم على ضوء التحفيز في المناطق العميقة من الدماغ من سطح الدماغ. وبخاصة، من الصعب على ضوء التحفيز للوصول إلى مناطق الدماغ العميق عند الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفض، كما الحال بالنسبة لتسجيلات من الحيوانات مستيقظا غالباً. هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل استجابات سبايك للضوء من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا. في هذا الأسلوب، يتم تسليم الضوء من خلال تسجيل الزجاج الكهربائي حيث أنه من الممكن أن تحفز موثوق العصبية مسجل مع الضوء في المناطق العميقة من الدماغ. هذا النظام أوبترودي مصنوعة خصيصا ويتألف من مواد متاحة وغير مكلفة وسهلة لتجميع.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، التي لها وظائف مختلفة. كيف تعمل هذه الأنواع المختلفة من الخلايا العصبية داخل الدائرة العصبية أحد الشواغل الرئيسية في علم الأعصاب. ومع ذلك، في العديد من مناطق الدماغ، كان من المستحيل التمييز بين أنواع الخلايا العصبية في التسجيلات في فيفو الأنشطة الكهربائية لأنه لا يوجد أي اختلاف واضح في الإشارة الكهربائية سبايك نفسها، مع بعض الاستثناءات. التقدم الذي أحرز مؤخرا في أوبتوجينيتيكس جعلت اختراق1،2. استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا التي يتم التعبير عن أوبسين حساسة للضوء (مثلاً، تشانيلرهودوبسين-2) في أنواع معينة من الخلايا العصبية، أصبح من الممكن التمييز بين أنواع الخلايا العصبية في كفاءة في فيفو تسجيلات3، 45،،6. في هذه الحيوانات، متحمسون الخلايا العصبية مع opsin حساسة للضوء بإعطاء المنبهات الخفيفة خلال التسجيلات الكهربائية، ولكن لا تكون الخلايا العصبية الأخرى. الخلايا العصبية أوبسين-إيجابية، ولذلك بسهولة تتميز عن سائر أنواع الخلايا العصبية بردودهم على ضوء.
في تجارب أوبتوجينيتيكس، أنها حاسمة بالنسبة لإيصال الضوء إلى موقع التسجيل. كطريقة غير الغازية، كثيرا ما يوجه الضوء من سطح الدماغ. ومع ذلك، لأنه يقلل القوة على ضوء ما يذهب من خلال أنسجة المخ، من الصعب أن تحفيز مناطق الدماغ العميقة من السطح في الدماغ. وبخاصة، من الصعب على ضوء التحفيز للوصول إلى مناطق الدماغ العميق عند الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفض، كما الحال بالنسبة لتسجيلات من الحيوانات مستيقظا غالباً. وكثيراً ما تم إجراء التجارب الكهربية على الحيوانات تخديره لحركة الجسم يسبب الضوضاء في التسجيلات. كما هو موثق جيدا، إلا أن التخدير المعروف لتغيير الاستجابات العصبية7،،من89،10. وبالتالي، من الضروري استخدام الحيوانات مستيقظا من أجل دراسة الاستجابات العصبية دون آثار التخدير الاصطناعي. على عكس التجارب مع الحيوانات تخديره، تتم التسجيلات الكهربية بعد الشفاء من جراحة في التجارب مع الحيوانات مستيقظا. أثناء الفاصل الزمني بين الجراحة والتسجيلات، الإفرازات الأنسجة كثيرا ما يتراكم على سطح الدماغ ويجعل الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفضة.
هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل تسجيلات وحدة واحدة من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا. في هذا الأسلوب، يتم تسليم الضوء من خلال تسجيل الزجاج الكهربائي حيث أنه من الممكن أن تحفز موثوق العصبية مسجل مع الضوء في المناطق العميقة من الدماغ. هذا النظام أوبترودي مصنوعة خصيصا ويتألف من مواد متاحة وغير مكلفة وسهلة لتجميع.
Protocol
Representative Results
Discussion
أوبتوجينيتيكس أصبحت أداة قوية في علم الأعصاب. وقد استخدمت لتحديد الخلايا العصبية محددة أنواع في فيفو ، فضلا عن التلاعب بأنشطة محددة المسارات العصبية. توضيح الأنشطة العصبية من مختلف أنواع الخلايا العصبية تعزز فهم إليه الدوائر العصبية. هنا، نحن أثبتت طريقة لإيصال الضوء إلى موقع التسج?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تؤيدها الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم كاكينهي منحة JP16K11200 وح 17 02223، والمنحة لتمويل البحوث من كانازاوا الطبية جامعة S2016-8 و C2017 3. ونشكر يوهيتشي كودا لدعمه في أخذ الصور.
Materials
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
Riferimenti
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
