Optogenetics identifikation af en Neuronal Type med et glas Optrode i vågen mus
Summary
Dette arbejde indfører en metode for at udføre en optogenetic single-enhed optagelse pålideligt fra en vågen mus ved hjælp af en skræddersyet glas optrode.
Abstract
Det er en stor bekymring i neurovidenskab hvordan forskellige typer for neuroner arbejde i neurale kredsløb. De seneste fremskridt i optogenetics har aktiveret identifikation af typen neuronal i i vivo elektrofysiologiske eksperimenter i bred hjerneregioner. I optogenetics eksperimenter er det afgørende at levere lys til webstedet optagelse. Det er imidlertid ofte svært at give regionerne dyb brain stimulation lys fra hjernens overflade. Det er især svært for stimulation lys til at nå de dybe hjerneregioner, når den optiske gennemsigtighed af hjernen overflade er lav, som det ofte er tilfældet med optagelser fra vågen dyr. Her, beskriver vi en metode til at registrere spike svar til lyset fra en vågen mus ved hjælp af en skræddersyet glas optrode. I denne metode leveres lys gennem optagelse glas elektroden så at det er muligt at pålideligt stimulere indspillet neuron med lys i de dybe hjerneregioner. Denne skræddersyede optrode systemet består af materialer, tilgængelig og billig og er let at samle.
Introduction
Centralnervesystemet består af forskellige typer for neuroner, som har forskellige funktioner. Hvordan disse forskellige typer for neuroner arbejde inden for de neurale kredsløb er en af de største bekymringer i neurovidenskab. Men i mange områder af hjernen, det har været umuligt at skelne de neuronale typer i i vivo optagelser af elektriske aktiviteter, fordi der er ingen klar forskel i de elektriske spike signal, selv, med nogle undtagelser. De seneste fremskridt i optogenetics har lavet en gennembrud1,2. Ved hjælp af transgene dyr som lysfølsomme opsin (f.eks.channelrhodopsin-2) er udtrykt i særlige neuronal typer, blev det muligt at skelne mellem typerne neuronal effektivt i i vivo optagelser3, 4,5,6. Neuroner med lysfølsomme opsin er glade ved at give lys stimuli under de elektriske optagelser i disse dyr, men andre neuroner er ikke. Opsin-positive neuroner, derfor er let skelnes fra andre neuron typer af deres svar til lys.
I optogenetics eksperimenter er det afgørende at levere lys til webstedet optagelse. Som en ikke-invasiv metode, er lyset ofte rettet fra hjernens overflade. Fordi Lysets styrke reducerer som det går igennem hjernevæv, er det imidlertid svært at stimulere regionerne dyb brain fra hjernens overflade. Det er især svært for stimulation lys til at nå de dybe hjerneregioner, når den optiske gennemsigtighed af hjernen overflade er lav, som det ofte er tilfældet med optagelser fra vågen dyr. Elektrofysiologiske eksperimenter har ofte udført på bedøvede dyr, fordi kroppen bevægelse forårsager støj i optagelserne. Som er veldokumenteret, men er anæstesi kendt for at ændre neurale svar7,8,9,10. Det er således nødvendigt at bruge vågen dyr for at studere neurale svar uden kunstige virkningerne af anæstesi. I modsætning til eksperimenter med bedøvede dyr udføres de elektrofysiologiske optagelser efter genopretning fra kirurgi i eksperimenter med vågen dyr. Under interval mellem kirurgi og optagelser, væv ekssudat ofte ophobes på hjernens overflade og gør den optiske gennemsigtighed af hjernen overflade lav.
Her, beskriver vi en metode til at registrere single-enhed optagelser fra en vågen mus ved hjælp af en skræddersyet glas optrode. I denne metode leveres lys gennem optagelse glas elektroden så at det er muligt at pålideligt stimulere den optagede neuron med lys i dyb hjerneregioner. Denne skræddersyede optrode systemet består af materialer, tilgængelig og billig og er let at samle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optogenetics er blevet et stærkt værktøj i neurovidenskab. Det er blevet udnyttet til at identificere specifikke neuron typer i vivo samt manipulere aktiviteter af specifikke neuronal veje. Præcisering af de neurale aktiviteter af forskellig neuronal type fremmer forståelsen af mekanismen af de neurale kredsløb. Her, viste vi en metode til at levere lys til webstedet optagelse gennem et glas elektrode i IC af vågen VGAT-ChR2 mus.
Der er flere kritiske trin i den beskrevne metod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne var støttet af Japan-samfund til fremme af videnskab KAKENHI Grant JP16K11200 og 17H 02223 og tilskud til forskning fra Kanazawa medicinske universitet S2016-8 og C2017-3. Vi takker Yuhichi Kuda for hans støtte i at tage billeder.
Materials
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
Riferimenti
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
