Optogenetica identificazione di un tipo di un neurone con un Optrode di vetro in topi svegli
Summary
Questo lavoro introduce un metodo per eseguire un unitario optogenetica registrazione in modo affidabile da un mouse sveglio usando un optrode di vetro su misura.
Abstract
È delle principali preoccupazioni in neuroscienze come i diversi tipi di neuroni funzionano in circuiti neurali. Gli avanzamenti recenti nella optogenetica hanno permesso l’identificazione del tipo di un neurone in vivo esperimenti elettrofisiologici nelle regioni del cervello ampio. In esperimenti di optogenetica, è fondamentale per fornire la luce per il sito di registrazione. Tuttavia, è spesso difficile fornire la luce di stimolazione per le regioni del cervello profondo dalla superficie del cervello. Soprattutto, è difficile per la luce di stimolazione raggiungere le regioni del cervello profondo quando la trasparenza ottica della superficie del cervello è bassa, come è spesso il caso con registrazioni da animali svegli. Qui, descriviamo un metodo per registrare le risposte di spike alla luce da un mouse sveglio utilizzando un optrode di vetro su misura. In questo metodo, la luce è consegnato attraverso l’elettrodo di vetro di registrazione in modo che è possibile stimolare in modo affidabile il neurone registrato con la luce nelle regioni del cervello profondo. Questo sistema su misura optrode costituito da materiali accessibile e poco costosi ed è facile da montare.
Introduction
Il sistema nervoso centrale è costituito da vari tipi di neuroni, che hanno funzioni diverse. Funzionano di questi diversi tipi di neuroni all’interno del circuito neurale è una delle preoccupazioni principali nell’ambito delle neuroscienze. Tuttavia, in molte regioni del cervello, è stato impossibile distinguere i tipi di un neurone in registrazioni in vivo di attività elettrica perché non c’è nessuna differenza evidente in segnale elettrico spike stesso, con alcune eccezioni. Gli avanzamenti recenti nella optogenetica hanno fatto un passo avanti1,2. Utilizzando animali transgenici in cui opsina sensibili alla luce (ad es., channelrhodopsin-2) è espresso in tipi neuronali specifici, è diventato possibile distinguere i tipi di un neurone in modo efficiente in vivo registrazioni3, 4,5,6. In questi animali, i neuroni con crepuscolare opsina sono eccitati dando stimoli leggeri durante le registrazioni elettriche, ma altri neuroni non sono. I neuroni di opsin-positivi, di conseguenza, sono facilmente distinguibili da altri tipi di neurone dalle loro risposte alla luce.
In esperimenti di optogenetica, è fondamentale per fornire la luce per il sito di registrazione. Come una metodica non invasiva, la luce è spesso diretto dalla superficie del cervello. Tuttavia, poiché la forza della luce riduce come esso passa attraverso il tessuto cerebrale, è difficile stimolare le regioni del cervello profondo dalla superficie del cervello. Soprattutto, è difficile per la luce di stimolazione raggiungere le regioni del cervello profondo quando la trasparenza ottica della superficie del cervello è bassa, come è spesso il caso con registrazioni da animali svegli. Esperimenti elettrofisiologici spesso sono stati effettuati su animali anestetizzati, perché il movimento del corpo provoca rumore nelle registrazioni. Come è ben documentato, tuttavia, l’anestesia è conosciuto per cambiare le risposte neurali7,8,9,10. Pertanto, è necessario utilizzare animali svegli al fine di studiare le risposte neurali senza gli effetti artificiali dell’anestesia. A differenza di esperimenti con animali anestetizzati, registrazioni elettrofisiologiche sono effettuate dopo il recupero da un intervento chirurgico negli esperimenti con gli animali svegli. Durante l’intervallo tra la chirurgia e le registrazioni, l’essudato di tessuto spesso si accumula sulla superficie del cervello e rende la trasparenza ottica della superficie del cervello basso.
Qui, descriviamo un metodo per registrare le registrazioni unitario da un mouse sveglio utilizzando un optrode di vetro su misura. In questo metodo, la luce è consegnato attraverso l’elettrodo di vetro di registrazione in modo che è possibile stimolare in modo affidabile il neurone registrato con la luce nelle regioni del cervello profondo. Questo sistema su misura optrode costituito da materiali accessibile e poco costosi ed è facile da montare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optogenetica è diventato un potente strumento in neuroscienze. È stato utilizzato per identificare tipi specifici neuroni in vivo così come manipolare l’attività di specifici circuiti neuronali. Il chiarimento delle attività neurale di diversi tipi di un neurone promuove la comprensione del meccanismo dei circuiti neurali. Qui, abbiamo dimostrato un metodo per fornire la luce per il sito di registrazione attraverso un elettrodo di vetro nell’IC di sveglio VGAT-ChR2 topi.
Ci sono …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono stati supportati da Japan Society per la promozione della scienza KAKENHI Grant JP16K11200 e 17H 02223 e la concessione per la ricerca di Kanazawa Medical University S2016-8 e C2017-3. Ringraziamo Yuhichi Kuda per il suo sostegno a scattare la foto.
Materials
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
Riferimenti
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
