깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

Summary

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

Abstract

그것은 어떻게 다른 신경 과학에서 중요 한 관심사 종류 뉴런의 신경 회로에서 작동. Optogenetics의 최근 발전은 광범위 한 뇌 영역에 vivo에서 electrophysiological 실험에서 신경 유형 식별을 활성화 했습니다. Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 그러나, 그것은 종종 뇌의 표면에서 깊은 두뇌 영역을 자극 빛을 제공 어렵다입니다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 빛을 스파이크 응답 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

Introduction

다양 한 종류의 다른 기능을 하는 신경 중추에 의하여 이루어져 있다. 이러한 서로 다른 유형의 신경 신경 회로 내에서 작동 하는 어떻게 신경 과학에서 중요 한 관심사 중 하나입니다. 그러나, 많은 두뇌 지구에서 그것은 되었습니다 하지 몇 가지 예외와 함께 전기 스파이크 신호 자체에 분명 차이가 있기 때문에 전기 활동의 비보에 녹음에 신경 종류를 구별 하는 것. Optogenetics의 최근 발전 돌파구^1,2를 만들었습니다. 빛에 민감한 opsin (예를 들어, channelrhodopsin-2) 특정 신경 종류에 표현 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여, 그것은 되었다 vivo에서 녹음^3, 에서 효율적으로 신경 종류를 구별할 수 ^4,,56. 이 동물에 빛에 민감한 opsin와 뉴런 전기 녹음 하는 동안 가벼운 자극을 제공 하 여 흥분 하지만 다른 신경 있습니다. Opsin 양성 신경, 따라서 쉽게 구별 된다 다른 신경 종류에서 빛에 대 한 답변으로.

Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 비-침략 적 방법으로 빛은 종종 뇌의 표면에서 감독. 그러나, 빛의 강도 감소 뇌 조직 속으로, 때문에 두뇌의 표면에서 깊은 두뇌 지구를 자극 하기 어렵다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 마 취 동물에 electrophysiological 실험 자주 수행 되었습니다 몸 움직임 녹음에 잡음을 발생 하기 때문에. 그러나 잘 설명 된 대로, 마 취 신경 응답^7,8,,910변경으로 알려져 있다. 따라서, 그것은 깨어 있는 동물을 사용 하 여 마 취의 인공 효과 없이 신경 응답을 공부 하기 위하여 필요가 있다. 마 취 동물 실험, 달리 electrophysiological 녹음 깨어 동물 실험에서 수술에서 회복 후 수행 됩니다. 수술과 기록 사이 간격 동안 조직 exudate 자주 뇌 표면에 축적 하 고 낮은 뇌 표면의 광 투명성을 만든다.

여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 단일 단위 기록 기록 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

Protocol

모든 절차는 동물 관리 위원회의 가나자와 의과대학의 승인와 일본의 생리 사회의 원칙에 따라 수행 됩니다. 1입니다. 건설 유리 Optrode 홀더 참고: 유리 optrode 홀더를 구축 하는 상업 전극 홀더 사용 됩니다 (그림 1A). 부드럽게 소유자의 배럴에서 압력 제어를 위해 스틸 튜브 밖으로 당겨. 드릴링에 의해 소유자의 배럴?…

Representative Results

그림 2, 우리는 팁 크기의 효과 유리 펫 펫 (그림 2A-B)의 끝에 빛 파워에의 길이 검사합니다. 가벼운 힘 1 m m 팁에서 배치 하는 광 파워 미터에 의해 측정 되었다. 팁 크기 전체 길이 변화 때 2.5 µ m 팁 크기 설정 하는 동안, 변화 하는 때 전체 길이 50 ± 2 mm로 설정 되었습니다. 유리 피 펫의 샹 크 8 m m로 설정 되었습니다…

Discussion

Optogenetics 신경 과학에 강력한 도구가 되고있다. 그것은 특정 신경 통로의 활동을 조작 뿐만 아니라 특정 신경 형식에서을 식별 비보에 이용 되었습니다. 신경 종류의 신경 활동의 명확한 신경 회로의 메커니즘의 이해를 촉진합니다. 여기, 우리는 깨어 VGAT ChR2 쥐의 IC에 유리 전극을 통해 녹음 사이트에 빛을 전달 하는 방법을 설명 했다.

설명 하는 방법을 몇 가지 중요 ?…

Materials

Electrode holder	Molecular Device	1-HL-U	pipette holder for microelectrode amplifier
Ceramic split mating sleeve	Thorlabs	ADAF1	f2.5 mm ferrule
Circuit board spacer	Teishin Denki	SPA-320	f8.0 mm, 20.0 mm long
Stereotaxic frame for mice	Narishige	SR-6M-HT	Stereotaxic instruments for mice
Manipulator	Narishige	NA	Manual manipulator
Superbond	Sun Medical	M: 204610557	Dental adhesive resin cement
Form2	Formlabs	NA	3D printer
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	Low toxicity silicone adhesive
Borosilicate glass capillaries	Narishige	GD-1.5	OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long
Fiber-optic patch cord	Doric Lenses	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63
Connectrized LED	Doric Lenses	LEDC-1B_FC	Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )
LED driver	Doric Lenses	LEDRV_1CH_1000	1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA
Electrode puller	Narishige	PB-7	Dual-stage glass micropipette puller
Borosilicate glass capillary	Narishige	GD-1.5	Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long
GENTACIN	MSD CO., Ltd	185711173	Antibiotic ointment
Terramycin®-LA	Zoetis	G 333	Oxytetracycline
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J	Jackson Labs	#14548	VGAT-ChR2 mice
Multiclamp 700B	Molecular Devices	2500-0157	Microelectrode amplifier