Optogenetics identifikasjon av en Neuronal med et Glass Optrode i våken mus
Summary
Dette arbeidet introduserer en metode for å utføre en optogenetic enheter innspilling pålitelig fra en våken musen benytter en skreddersydde glass optrode.
Abstract
Det er svært viktig i nevrovitenskap hvordan ulike typer nerveceller virker i nevrale kretser. Nylige fremskritt innen optogenetics har aktivert identifikasjonen nevronale type i vivo elektrofysiologiske eksperimenter i bred hjernen regioner. Optogenetics eksperimenter er det avgjørende å levere lyset til webområdet opptak. Imidlertid er det ofte vanskelig å levere stimulering lyset til regionene dypt hjernen fra hjernens overflate. Det er spesielt vanskelig stimulering lyset å nå regionene dypt hjernen når optisk gjennomsiktigheten av hjernen overflaten er lav, som ofte er tilfellet med innspillinger fra våken dyr. Her beskriver vi en metode for å registrere spike svar til lyset fra en våken musen benytter en skreddersydde glass optrode. I denne metoden leveres lyset gjennom opptak glass elektroden slik at det er mulig å pålitelig stimulere innspilte Nevron med lys i dypt hjernen regioner. Skreddersydde optrode systemet består av tilgjengelig og rimelig materialer og er lett å montere.
Introduction
Sentralnervesystemet består av ulike neurons, som har forskjellige funksjoner. Hvordan disse typer nerveceller virker i nevrale krets er en av de store bekymringene i nevrovitenskap. Men i mange områder av hjernen, har det vært umulig å skille neuronal typene i i vivo innspillinger av elektriske aktiviteter fordi det er ingen klar forskjell i elektriske spike signalet, med noen unntak. Nylige fremskritt innen optogenetics har gjort et banebrytende1,2. Bruke transgene dyr som lys-sensitive opsin (f.ekschannelrhodopsin-2) uttrykkes i konkrete neuronal typer, ble det mulig å skille neuronal typene effektivt i i vivo opptak3, 4,5,6. I disse dyrene, neurons med lys-sensitive opsin er begeistret av gir lys stimuli i elektriske opptakene, men andre neurons er ikke. Opsin-positive neurons, derfor skilles lett fra andre Nevron typer av sine svar til lys.
Optogenetics eksperimenter er det avgjørende å levere lyset til webområdet opptak. Som en ikke-invasiv metode, er lyset ofte rettet fra hjernens overflate. Men fordi lyset styrke reduserer som hjernevev, er det vanskelig å stimulere regionene dypt hjernen fra hjernens overflate. Det er spesielt vanskelig stimulering lyset å nå regionene dypt hjernen når optisk gjennomsiktigheten av hjernen overflaten er lav, som ofte er tilfellet med innspillinger fra våken dyr. Elektrofysiologiske eksperimenter er ofte utført på bedøvet dyr fordi kroppsbevegelse forårsaker støy i opptak. Som er godt dokumentert, men er anestesi kjent endre nevrale svar7,8,9,10. Dermed er det nødvendig å bruke våken dyr for å studere nevrale svar uten kunstige effekten av anestesi. I motsetning til eksperimenter med bedøvet dyr utføres elektrofysiologiske innspillingene etter utvinning fra kirurgi i eksperimenter med våken dyr. Under intervall mellom kirurgi og opptak, vev sårvæske ofte akkumuleres på hjernen overflaten og gjør optisk gjennomsiktigheten av hjernen overflaten lav.
Her beskriver vi en metode for å registrere enheter opptak fra en våken musen benytter en skreddersydde glass optrode. I denne metoden leveres lyset gjennom opptak glass elektroden slik at det er mulig å pålitelig stimulere innspilte Nevron med lys i dypt hjernen regioner. Skreddersydde optrode systemet består av tilgjengelig og rimelig materialer og er lett å montere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optogenetics har blitt et kraftig verktøy i nevrovitenskap. Det har vært utnyttet for identifiserer bestemte Nevron typer i vivo samt manipulere aktivitetene til bestemte neuronal stier. Klargjøring av nevrale aktiviteter neuronal ulike fremmer forståelse av mekanismen av nevrale kretser. Her viste vi en metode for å levere lyset for innspilling området gjennom et glass elektrode i IC våken VGAT-ChR2 mus.
Det er flere viktige skritt i metoden beskrevet. Først er det en forutse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ble støttet av Japan Society for fremme av vitenskap KAKENHI Grant JP16K11200 og 17H 02223 og stipend for forskning fra Kanazawa medisinske universitet S2016-8 og C2017-3. Vi takker Yuhichi Kuda for sin støtte i å ta bilder.
Materials
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
Riferimenti
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
