Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados

Summary

Este trabalho apresenta um método para executar uma optogenetic unidade única gravação confiável de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida.

Abstract

É uma grande preocupação em neurociência como diferente tipos de neurônios funcionam em circuitos neurais. Avanços recentes em optogenetics permitiram a identificação do tipo neuronal na vivo eletrofisiológicos experiências em regiões do cérebro amplo. Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. No entanto, muitas vezes é difícil entregar-se a luz de estimulação às regiões profundas do cérebro da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Aqui, descrevemos um método para gravar respostas de pico à luz de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz nas regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.

Introduction

O sistema nervoso central consiste de vários tipos de neurônios, que têm funções diferentes. Como esses diferentes tipos de neurônios funcionam dentro do circuito neural é uma das principais preocupações da neurociência. No entanto, em muitas regiões do cérebro, tem sido impossível distinguir os tipos neuronais em gravações na vivo de actividades eléctricas, porque não há nenhuma diferença clara no sinal elétrico spike em si, com algumas exceções. Avanços recentes em optogenetics fizeram uma descoberta^1,2. Usando animais transgénicos na qual opsin sensíveis à luz (por exemplo, channelrhodopsin-2) é expressa em tipos específicos de neurônios, tornou-se possível distinguir os tipos neuronais eficientemente na vivo gravações^{3, 4,5,6}. Nestes animais, os neurônios com opsin sensíveis à luz estão animados, dando estímulos de luz durante as gravações elétricas, mas outros neurônios não são. Os neurônios opsin-positivo, portanto, facilmente são distintos dos outros tipos de neurônio por suas respostas à luz.

Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. Como um método não-invasivo, a luz é muitas vezes dirigida da superfície do cérebro. No entanto, porque a força da luz reduz conforme passa pelo tecido cerebral, é difícil estimular as regiões cerebrais profundas da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Eletrofisiológicos experimentos frequentemente foram realizados em animais anestesiados porque o movimento do corpo provoca ruído nas gravações. Como está bem documentado, no entanto, anestesia é conhecida para alterar as respostas neurais^7,8,9,10. Assim, é necessário utilizar animais acordados para estudar as respostas neurais, sem os efeitos artificiais da anestesia. Ao contrário das experiências com animais anestesiados, as gravações eletrofisiológicas são executadas após a recuperação da cirurgia nos experimentos com animais acordados. Durante o intervalo entre a cirurgia e as gravações, o exsudato tecido frequentemente se acumula na superfície do cérebro e faz com que a transparência óptica da superfície do cérebro baixa.

Aqui, descrevemos um método para gravar gravações unitárias de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz em regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.

Protocol

Todos os procedimentos são feitos em conformidade com os princípios orientadores da sociedade Physiological do Japão e com a aprovação do Animal conta Comissão de Kanazawa médica Universidade. 1. construção do titular do Optrode de vidro Nota: Para construir um suporte de optrode de vidro, um porta-eletrodo comercial é utilizado (figura 1A). Suavemente retire o tubo de aço para controle de pressão do cilindro do ti…

Representative Results

Na Figura 2, examinamos os efeitos do tamanho da ponta e do comprimento das pipetas de vidro sobre o poder de luz na ponta das pipetas (Fig. 2A-B). O poder da luz foi medido por um medidor de potência óptica colocado 1 mm da ponta. O comprimento total foi definido como 50 ± 2 mm quando o tamanho da ponta variado, enquanto o tamanho da ponta foi definido como 2,5 µm, quando todo o comprimento variado. A haste …

Discussion

Optogenetics tornou-se uma ferramenta poderosa em neurociência. Ele tem sido utilizado para identificar neurônio específico tipos na vivo , bem como manipular as atividades das vias neuronais específicas. O esclarecimento da actividade neural de diferentes tipos neuronais promove a compreensão do mecanismo dos circuitos neurais. Aqui, temos demonstrado um método para fornecer a luz para o local de gravação através de um eléctrodo de vidro na IC de ratos de VGAT-ChR2 acordados.

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Materials

Electrode holder	Molecular Device	1-HL-U	pipette holder for microelectrode amplifier
Ceramic split mating sleeve	Thorlabs	ADAF1	f2.5 mm ferrule
Circuit board spacer	Teishin Denki	SPA-320	f8.0 mm, 20.0 mm long
Stereotaxic frame for mice	Narishige	SR-6M-HT	Stereotaxic instruments for mice
Manipulator	Narishige	NA	Manual manipulator
Superbond	Sun Medical	M: 204610557	Dental adhesive resin cement
Form2	Formlabs	NA	3D printer
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	Low toxicity silicone adhesive
Borosilicate glass capillaries	Narishige	GD-1.5	OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long
Fiber-optic patch cord	Doric Lenses	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63
Connectrized LED	Doric Lenses	LEDC-1B_FC	Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )
LED driver	Doric Lenses	LEDRV_1CH_1000	1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA
Electrode puller	Narishige	PB-7	Dual-stage glass micropipette puller
Borosilicate glass capillary	Narishige	GD-1.5	Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long
GENTACIN	MSD CO., Ltd	185711173	Antibiotic ointment
Terramycin®-LA	Zoetis	G 333	Oxytetracycline
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J	Jackson Labs	#14548	VGAT-ChR2 mice
Multiclamp 700B	Molecular Devices	2500-0157	Microelectrode amplifier