वयस्क त्वचा ऊतक से प्राथमिक मानव Keratinocytes को अलग करने के लिए एक सरलीकृत और कुशल विधि
Summary
यहां हम कुशलतापूर्वक वयस्क त्वचा के ऊतकों से प्राथमिक मानव keratinocytes को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि से पारंपरिक प्रक्रिया सरल टीका माध्यम में रॉक अवरोधक Y-२७६३२ का उपयोग करने के लिए सहज चमड़े की कोशिकाओं से एपिडर्मल कोशिकाओं को अलग ।
Abstract
प्राथमिक मानव ताजा त्वचा के ऊतकों और इन विट्रो में विस्तार से अलग keratinocytes व्यापक रूप से प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है । मानव keratinocytes के पारंपरिक अलगाव विधि एक दो कदम अनुक्रमिक एंजाइमी पाचन प्रक्रिया है, जो कम सेल वसूली दर और कम सेल के कारण वयस्क ऊतकों से प्राथमिक कोशिकाओं पैदा करने में अक्षम साबित किया गया है शामिल व्यवहार्यता. हम हाल ही में एक उंनत विधि की सूचना के लिए मानव प्राथमिक एपिडर्मल जनक कोशिकाओं को अलग त्वचा के ऊतकों कि Rho कळेनासे अवरोधक वाई-२७६३२ माध्यम में इस्तेमाल से । पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, इस नई विधि सरल, आसान है, और कम समय लेने वाली, और बढ़ाता है उपकला स्टेम सेल उपज और उनके स्टेम सेल विशेषताओं को बढ़ाता है । इसके अलावा, नई पद्धति dermis से एपिडर्मिस की जुदाई की आवश्यकता नहीं है, और इसलिए, वयस्क ऊतकों के विभिंन प्रकार से कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त है । इस नए अलगाव विधि पारंपरिक तरीकों की प्रमुख कमियों पर काबू पाता है और अधिक दोनों प्रयोगशाला के लिए और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उच्च शक्ति के साथ एपिडर्मल कोशिकाओं की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए उपयुक्त है । यहां, हम विस्तार में नई विधि का वर्णन ।
Introduction
लक्ष्य के लिए विशेष रूप से नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए, वयस्क ऊतकों से प्राथमिक मानव keratinocytes (HKCs) को अलग करने के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया गया था । त्वचा एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं, त्वचा की बेसल परत में स्थानीयकृत, पैदा करना और अंतर करने के लिए एक उच्च क्षमता के अधिकारी और त्वचा के कार्यों को बनाए रखने के लिए keratinocytes प्रदान1,2,3, 4. त्वचा के ऊतकों से अलग HKCs व्यापक रूप से त्वचा ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्जनन प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से क्षतिग्रस्त त्वचा की मरंमत में और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए जीन थेरेपी में5,6। HKC-आधारित अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण समस्या को कुशलतापूर्वक अलग और बड़ी संख्या में HKCs की उच्च क्षमता के साथ इन विट्रो7,8का विस्तार करने के लिए है । हालांकि विभिंन अनुसंधान समूहों के तरीकों को विकसित किया है HKCs की तरह स्टेम की संस्कृतियों का उत्पादन, इन तरीकों को कई बार कर रहे है और प्रदर्शन करने के लिए जटिल और कम सेल पैदावार के रूप में अंय सीमाएं हैं, और त्वचा के नमूने के प्रकार द्वारा सीमित किया जा रहा है 9का इस्तेमाल किया । उदाहरण के लिए, पारंपरिक विधि त्वचा के ऊतकों से HKCs को अलग करने के लिए dermis6से एपिडर्मिस की जुदाई के साथ एक दो कदम एंजाइमी पाचन शामिल है । यह विधि आमतौर पर नवजात ऊतकों के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन यह बहुत मुश्किल हो जाता है जब वयस्क ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया ।
Y-२७६३२, Rho के एक अवरोधक-जुड़े प्रोटीन कळेनासे (रॉक), के लिए काफी एपिडर्मल स्टेम सेल अलगाव और कॉलोनी विकास की क्षमता बढ़ाने की सूचना दी गई है10,11,12। पिछले एक अध्ययन में, हमें पता चला कि Y-२७६३२ एपिडर्मल कोशिकाओं के क्लोनल विकास की सुविधा है, लेकिन अंतर से आसंजन13अणुओं की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के द्वारा चमड़े की कोशिकाओं की उपज को कम कर देता है । हमने एक नए वातानुकूलित टीका माध्यम की भी स्थापना की, जिसे जी-माध्यम कहा जाता है, जो प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं के विकास और उपज का समर्थन करता है । जी के संयोजन के माध्यम से वाई-२७६३२ के साथ मध्यम, इस उपंयास विधि सहज एंजाइम पाचन के बाद एपिडर्मल और चमड़े की कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं, इस प्रकार एपिडर्मिस के कदम-dermis जुदाई13,14को हटाने । पिछले रिपोर्ट के आधार पर, अब हम इस नई विधि की विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए वयस्क त्वचा ऊतक से HKCs अलग ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक HKCs व्यापक रूप से अधिक से अधिक तीन दशकों के लिए क्लीनिक में घावों के इलाज के लिए उपयोग किया गया है और, उस समय के बाद से, यह हमेशा कुशलतापूर्वक एक समय पर तरीके से नैदानिक अनुप्रयोगों …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFA0104604), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSFC, ८१७७२०९३), सूज़ौ (ZXL2015128) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम के सामान्य कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया था, Jiangsu प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (BK20161241), और एक शेडोंग Taishan विद्वान पुरस्कार (tshw201502065) ।
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
Riferimenti
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