Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel
Summary
Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.
Abstract
Keratinocytes humanos primarios aislados de los tejidos de la piel fresca y su expansión en vitro han sido ampliamente utilizados para la investigación de laboratorio y para usos clínicos. El método de aislamiento convencionales de keratinocytes humanos implica un procedimiento de digestión enzimática secuencial de dos etapas, que ha demostrado ser ineficiente en la generación de primario de células de tejidos adultos debido a la tasa de recuperación celular baja y reducida de la célula viabilidad. Recientemente nos informó un método avanzado para aislar las células progenitoras epidérmico primario humano de tejidos de la piel que utiliza el inhibidor de la cinasa Rho Y-27632 en el medio. En comparación con el protocolo tradicional, este nuevo método es más simple, más fácil y menos desperdiciadora de tiempo y aumenta la producción de células madre epiteliales y realza sus características de la célula de vástago. Además, la nueva metodología no requiere la separación de la epidermis de la dermis y por lo tanto, es conveniente para aislar células de diferentes tipos de tejidos adultos. Este nuevo método de aislamiento supera las principales deficiencias de los métodos convencionales y es más conveniente para producir gran número de células epidérmicas con alta potencia para laboratorio y aplicaciones clínicas. Aquí, describimos el nuevo método en detalle.
Introduction
El objetivo era desarrollar un protocolo sencillo y eficaz para aislar queratinocitos humanos primaria (HKCs) de tejidos adultos, especialmente para aplicaciones clínicas. La piel las células madre epidérmicas, localizadas en la capa basal de la piel, poseen un alto potencial para proliferar y diferenciarse y queratinocitos para mantener las funciones de la piel1,2,3, 4. HKCs aislados de la piel, los tejidos son ampliamente utilizados con fines piel tejido ingeniería y regeneración, especialmente en la reparación de la piel dañada y en terapia génica para aplicaciones clínicas5,6. La cuestión clave para aplicaciones basadas en HKC es aislar y ampliar el gran número de HKCs con alto potencial en vitro7,8. Aunque varios grupos de investigación han desarrollado métodos para producir cultivos de tallo-como HKCs, estos métodos son a veces lentos y complicados para realizar y tener otras limitaciones, tales como rendimientos bajos de células y está limitado por el tipo de espécimen de la piel usa9. Por ejemplo, el método tradicional para aislar HKCs de tejidos de la piel implica una digestión enzimática de dos etapas con una separación de la epidermis de la dermis6. Este método generalmente funciona bien para los tejidos neonatales, pero se hace muy difícil cuando se utiliza para aislar células de tejidos adultos.
Y-27632, un inhibidor de la cinasa de la proteína Rho (roca), se ha divulgado para mejorar significativamente la eficiencia de la célula de vástago epidérmicas aislamiento y Colonia de crecimiento10,11,12. En un estudio anterior, descubrimos que Y-27632 facilita el crecimiento clonal de las células epidérmicas, pero reduce el rendimiento de las células cutáneas controlando diferencialmente a la expresión de moléculas de adhesión13. También establecimos un nuevo medio de inoculación acondicionado, llamado G-medio, que apoya el crecimiento y rendimiento de las células epidérmicas primarias. Mediante la combinación de G-medio con Y-27632, este novedoso método espontáneamente puede separar las células epidérmicas y dérmicas después de la digestión de la enzima, eliminando así el paso de epidermis dermis separación13,14. Basado en informes anteriores, ahora Describimos el procedimiento detallado de este nuevo método para aislar HKCs del tejido de la piel adulta.
Protocol
Representative Results
Discussion
HKCs primarias cultivadas han sido ampliamente utilizados para tratar heridas en clínicas durante más de tres décadas y, desde entonces, ha sido siempre importante obtener eficientemente un número suficiente de células para aplicaciones clínicas en tiempo y forma. Por lo tanto, en la práctica, el método de aislamiento convencional, que requiere la separación de la epidermis de la dermis, es difícil satisfacer estas demandas, debido al bajo rendimiento de las células y la baja capacidad de las células adultas …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el nacional clave de investigación y desarrollo programa de China (2017YFA0104604), el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (NSFC, 81772093), la ciencia y la tecnología desarrollo programa de Suzhou (ZXL2015128), la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Jiangsu (BK20161241) y un Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
Riferimenti
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