全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース
Summary
ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片および counterstaining の方法について述べる。これはティッシュ セクションにも適用することができます開発における遺伝子の発現を監視する簡単かつ迅速な手続を器官または培養細胞。
Abstract
遺伝子発現のレポーター、細胞系譜研究におけるトレーサーとして、大腸菌の LacZ遺伝子、β-ガラクトシダーゼは主として使用されます。古典的な化学反応は基質 X gal が見やすい不溶性の青い沈殿物を生成する鉄と鉄イオンとの組み合わせでの加水分解に基づいています。したがって、開発が進むにつれて、β-ガラクトシダーゼ活性は興味の遺伝子の発現パターンのためのマーカーとして機能します。ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片と counterstaining の後続のメソッドについて述べる。さらに、X gal 胚の深い地域で染色を見やすくします全体の胚を明らかにするための手順が提供されます。一貫性のある結果は、反応条件の最適化がバック グラウンド アクティビティを最小限に抑える必要がこの手順を実行することによって得られます。試金の制限もに配慮すべき、特に全台紙の染色で, 胚の大きさ。我々 のプロトコルは、敏感な切片として全臓器にさらに適用できるマウス開発中に β-ガラクトシダーゼ検出のための信頼性の高い方法を提供します。したがって、開発全体を通して動的な遺伝子発現パターンを全胚で、このプロトコルを使用して、簡単に分析できますが、パラフィン切片後も細胞レベルで詳細な式を評価できます。
Introduction
特定の遺伝子発現パターンを記述するためにレポーター遺伝子マーカーとしての使用は、ショウジョウバエから哺乳類を最優先されています。トランスジェニック、ノックアウト動物を含む実験でエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 遺伝子細菌の β-ガラクトシダーゼ (LacZ) は最も広く使用されている1,2,3,のいずれか4. β-ガラクトシダーゼ (β gal) 単糖類 (ブドウ糖そしてガラクトース)5に β-ラクトースリプレッサー (乳糖) などの加水分解を触媒します。その最も一般的に使用される基質は X-ガロン (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)、β-ガラクトシダーゼを生み出してラクトースオペロンとガラクトースで加水分解する配糖体です。最初は逆に酸化二量体で使用するとカリウム フェリと組み合わせる-鉄シアン化物の生成特性不溶性、青色沈殿 (図 1)6。
LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として 30 年以上前に使用される開始7,8。LacZの挿入、通常使用できるようにされるトランスジェニック動物、特定の挿入を含む細胞を可視化する細菌および細胞培養の内因性のトレーサーとして開いたリーディング ・ フレームの代わりに内因性プロモーターの下流開発9中遺伝子発現パターン。この点では、β-ガラクトシダーゼ活性の可視化使用されています広範囲ショウジョウバエの全体の組織を単一セルから発達と細胞のプロセスを理解します。ショウジョウバエの遺伝学はゲノム内の場所ランダムには、 LacZレポーター遺伝子を含んでいる変更された P 要素構造を挿入する安定したラインを生成を支持します。したがって、エンハンサー要素の影響下に置かれるときそれは過去二十年10の間に多くの遺伝子の発現パターンの体系的な分析を許可している組織の特定方法でその表現を駆動があります。また、 LacZ遺伝子の発現を監視するトランスジェニック マウスも使用するタゲネーシスによる遺伝子組換えイベントの検出を介した交叉およびキメラ解析の突然変異体の胚性幹細胞誘導体の局在11、一時的同様にある特定の臓器のLacZ発現の制御を容易にします。また、全胚で、β-ガラクトシダーゼ活性の検出可能性があります便利なの遺伝子発現の変化を解析するさまざまな発達段階にわたって観察できる強度の異なる差分の染色パターンを生産8,12。
この記事でマウス胚の初期の発達段階で全台紙組織染色 X gal 遺伝子発現を可視化するためのプロトコルを提案する.パラフィン埋組織や胚後標識細胞全載標本または細胞レベルでの正確な検出を支持する高感度・安価な手法としてこの組織化学的手法を提案する.メソッドは、13他の方法と比較すると最低限の背景を持つマウス組織染色の直接可視化できます。
Protocol
すべての実験手順は、CNIC (セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares) と、マドリード ・ アウトノマ コムニダード最小限動物の苦しみを確保するための動物実験の倫理委員会によって承認されました。 1. (E12.5 に E8.5) から妊娠のマウス胚のコレクション 頚部転位または CO2吸入のいずれかによって妊娠マウスを犠牲に。最初の日は、膣にプラグは胚と考え?…
Representative Results
(図 1および図 2) 全体のマウス胚における基板として X gal を使用して β-ガラクトシダーゼの組織化学的反応の標準的なプロトコルを適用した結果を示す.このプロトコルを使用して、我々 は胚発達段階 (E9.5、E11.5、E12.5) を別に膜型マトリックスメタロプロテアーゼ 4 (Mt4 mmp) 式を調べて、内因性の制御の下で LacZ レポーター?…
Discussion
エシェリヒア属大腸菌の LacZ の遺伝子は、その高い感度と検出の容易さのため記者として遺伝子発現パターンの研究に広く使用されています。この議定書では、簡単かつ迅速に安価なだけでなく、実行する酵素反応に基づく β gal 式を検出するための古典的な方法について説明します。このメソッドは、全台紙胚、そのまま臓器、組織切片や培養細胞での大幅な変更なしも適用できま?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares (CNIC) でその技術支援の病理組織学的サービスに感謝したいと思います。我々 はまた私たちのプロジェクトを支援するためと原稿の彼女の重要な読書の親切の提供する Mt4 mmpLacZマウスの清木元治博士と博士アリシア G. アロヨを感謝します。我々 はこの記事を校正のピーター ・ ボニーを感謝したいと思います。この作品は、C.S.C. に与えられる助成金 (# 2017UEM01) によるエウロペア デ マドリッドによって支えられました。
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Blanco, M. J., Learte, A. I., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).