Häri, presenterar vi ett protokoll som Detaljer de tekniska aspekterna och väsentliga krav för att säkerställa robust sekvensanalys för IG-genen hos patienter med kronisk lymfatisk leukemi (KLL), baserat på ackumulerade erfarenheter av initiativet europeisk forskning på KLL (ERIC).
Under B-cell mognad, den komplexa processen att immunglobulin (IG) gen V D J rekombination i kombination med somatisk hypermutation (SHM) ger upphov till en unik DNA-sekvens inom varje enskild B-cell. Eftersom B-cell maligniteter resultera från den klonala expansionen av en enda cell, utgör IG gener en unik molekylär signatur gemensamma för alla maligna celler inom en enskild patient; IG genen rearrangements kan således användas som klonal markörer. Förutom att tjäna som en viktig klonal identifierare, kan IG gensekvensen agera som en ‘molekylär tidslinje’ eftersom det är associerade med specifika utvecklingsstadier och därmed speglar historien av den B-cellen som är involverade i neoplastiska omvandlingen. Dessutom för vissa maligniteter, särskilt kronisk lymfatisk leukemi (KLL), IG gensekvensen innehar prognostisk och potentiellt förutsägande funktioner. Som sagt, extrapolera meningsfulla slutsatser från IG gen sekvensanalys vore omöjligt om robusta metoder och verktyg inte hade tillgång till stöd i sin analys. Denna artikel, den enorma erfarenhet av europeisk forskning initiativet om KLL (ERIC), detaljer de tekniska aspekterna och väsentliga kraven nödvändiga för att säkerställa tillförlitliga och reproducerbara IG gen sekvensanalys i KLL, ett test som rekommenderas nu för alla KLL patienter före behandling. Mer specifikt beskrivs olika analytiska stadier alltifrån clonotypic IG gen omordningen identifiering och bestämning av av nukleotidsekvensen noggranna kliniska tolkningen av IG gene sequence data.
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL), den vanligaste formen av leukemi hos vuxna i västvärlden, kännetecknas av mogen neoplastiska B celler1klonal expansion. Ur klinisk synvinkel är sjukdomsförloppet extremt varierande med vissa patienter upplever en aggressiv sjukdom som kräver behandling mycket tidigt efter diagnos, och ofta skovvis eller att vara refraktära mot behandling. Detta står i skarp kontrast till en betydande andel av patienterna (~ 30%) som presenterar med en indolent sjukdom, aldrig kräva behandling och har en förväntad livslängd liknar friska åldersmatchade individer2. Denna kliniska heterogenitet återspeglas i mångfalden av de molekylära avvikelser som finns i patienter med KLL som i slutändan driver patogenes och progression av denna sjukdom3.
Att fastställa en korrekt KLL-diagnos är oftast enkel, dock ovannämnda kliniska heterogenitet kan hindra en effektiv hantering av patienter med KLL och understryker behovet av prognostiska och prediktiva markörer som kunde bistå i behandling beslutsfattande2. Många studier har försökt att förfina förutsägelsen av KLL, kulminerade i ett överflöd av nya kliniska och biologiska markörer som de föreslagna4. Mutationsstatus av genen clonotypic immunglobulin tunga variabel (IGHV) är en av de mest robusta prognostiska markörerna i KLL, till stor del beror på att (i) det förblir stabil över tid och eftersom sjukdomen fortskrider, och (ii) det är oberoende av andra kliniska och biologiska parametrar5. Att trots mycket få, om några markörer, inklusive IGHV mutationsstatus, för närvarande tillämpas i klinisk rutin vid tidpunkten för diagnos.
Första rapporterna på den kliniska nyttan av IG gensekvensering i KLL datum så långt tillbaka som 1999, då 2 oberoende studier rapporterade att patienter med ingen eller en minimal somatisk hypermutation (SHM) belastning (unmutated KLL, U-KLL) har sämre prognos än patienter som bär en högre SHM börda (muterade KLL, M-KLL)6,7. Mer specifikt, U-KLL gruppen bestod av fall härbärgerat clonotypic IGHV gener med få eller inga SHM och därmed en hög procent identitet till den närmaste könsceller IGHV gen (≥98%), medan M-KLL bestod av fall med en högre mutationsanalys belastning (procent identitet till den närmaste könsceller IGHV gen < 98%). Sedan dessa tidiga studier, har det kontinuerligt visat att U-KLL fall visar en kortare tid till den första behandling (TTFT) och total överlevnad (OS) jämfört M-KLL.
I efterhand markeras dessa nyskapande studier en nyckelroll av B-cells receptor (BcR) IG i KLL patobiologi, därigenom bereda vägen för omfattande forskning i KLL-microenvironmental interaktioner vilket i sin tur lett till en mer omfattande bedömning av den biologiska heterogeniteten i sjukdom8,9. Senare studier har gett ytterligare stöd för betydelsen av immunogenetisk analyser i KLL genom att avslöja att enskilda fall kan kluster grupper på grund av delning (kvasi) identiska BcR IG gensekvenser, ett fenomen kallas BcR IG stereotypy10 ,11,12,13. Ackumulerande bevis stöder uppfattningen att patienter som tilldelats samma stereotypa delmängd harbor liknande clinicobiological egenskaper som tydligt skiljer dem från andra KLL patienter inom kategorin SHM samma men med olika IG gensekvenser; Det har faktiskt rapporterats att kategorisering av patienter med KLL baserat på BcR IG stereotypy ytterligare förfinar bulk segregeringen av patienter med KLL i U-KLL eller M-KLL grupper14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Ur klinisk synvinkel är det anmärkningsvärt att SHM status av clonotypic IGHV gen verkar korrelera med ett specifikt svar på chemoimmunotherapy. I synnerhet M-KLL-patienter behandlas med en kombination av fludarabin/cyklofosfamid/rituximab (FCR), gold standard behandling för medicinskt fit KLL-patienter som saknar TP53 genen defekter, uppvisade betydligt längre progressionsfri överlevnad (PFS) och OS jämfört med U-KLL patienter som fick den samma behandling21,22,23. Därför identifiering av SHM status blivit viktigt särskilt för att bistå i terapeutiska förvaltningen av KLL patienter dvs en prediktiv markör, snarare än för att bedöma det kliniska förloppet hos den sjukdom dvs en prognostisk markör. I själva verket, enligt den senaste uppdateringen av NCI-sponsrade riktlinjer från the International Workshop på KLL, bör SHM status av ordnas IGHV gener vara beslutsamma i alla KLL fall före behandlingsstart i både allmänmedicin och klinisk Trials24. Dessutom på grund av det senaste godkännandet av ny behandling agenter och det växande antalet droger i prövningar, kan SHM status av IG molekyl spela en ännu större roll i terapeutisk behandling av patienter med KLL i nära framtida5.
Denna rapport beskriver alla aspekter av IG-gen sekvensanalys, börjar med att välja lämpligt material och kulminerade med den kliniska tolkningen av resultaten sekvensering. Fördjupad bedömning av dessa steg är viktigt i diagnostiska rutinen för produktion av tillförlitliga resultat och för att säkerställa korrekt patientens stratifiering inom kliniska prövningar. Protokoll som stöd i harmoniseringen av IG-gen sekvensanalys, vilket säkerställer att resultaten är jämförbara mellan olika laboratorier.
Studien av IG-gener i KLL har varit avgörande för att ge en bättre förståelse till sjukdom patobiologi men också för att förbättra patientens riskstratifiering. Det är därför avgörande att flera steg tillvägagångssättet av IG gen sekvensanalys och efterföljande tolkning av sekvensdata utförs på ett standardiserat sätt. Tillgången på lämpliga och tillräckliga patientmaterial och tidpunkten för provtagning bör inte påverka förmågan att utföra IG gen mutationsanalys analys eftersom testet kan utföras på PB och på varje prov med en hög KLL tumör cell sammanräkning. Separation av mononukleära celler med hjälp av gradient separationsmetoder utförs rutinmässigt i diagnostiska laboratorier, och som alltid, försiktighet bör iakttas när du lägger till blod/RPMI lösningen till röret som innehåller gradient; denna uppgift bör utföras i en långsam och mild sätt att undvika störande toningen och förhindra förlust av celler.
Efter cellseparation extraheras nukleinsyror. Båda gDNA och cDNA är lämpliga för SHM analys av clonotypic IGH omordningen, men det finns fördelar och nackdelar för användning av antingen material. Laboratoriet arbetsflödet fortsätter snabbare när du använder gDNA eftersom ingen omvänd Transkription skall utföras innan PCR-amplifiering. Som sagt, med gDNA som substrat för PCR kan resultera i förstärkning av både produktiva och improduktiva rearrangements vilket i sin tur kan leda till ytterligare praktiska laborationer, dvs rening eller gel excision av flera PCR-produkter och enskilda sekvensering av alla omflyttningar. När man jämför de gDNA och cDNA förhållningssätt, det senare måste en omvänd Transkription steg utföras innan du fortsätter med PCR-amplifiering. Dock i detta fall, i de flesta fall blir endast produktiv IG rearrangements förstärkt och därefter sekvenserade. Således blir endast en enda PCR-produkt renat och sekvenserade, medan resultaten tolkning är mer okomplicerat.
Effektiviteten av förstärkning beror till stor del på kvaliteten på den gDNA/cDNA, som bör bedömas med hjälp av en känslig kvantifiering metod och primers utnyttjas. Primers används är kritiska till hela analytiska proceduren eftersom den noggrann bestämningen av SHM nivån kan endast uppnås genom att förstärka hela sekvensen av den ordnas IGHV gen. En fullängds omflyttning kan endast bedömas om 5′ IGHV ledare primers används, vilket således motiverar ERIC senaste rekommendationer för användning av ledare primers27. Användningen av alternativa grundfärger, leder till förstärkning av ofullständig IGHV-IGHD-IGHJ genen rearrangements, är inte lämpligt för IGHV gen mutationsanalys analys, och därför vi rekommenderar mot. Det enda undantaget avser fall som upprepade gånger ger negativa resultat när IGHV ledare primers används och analys av nya patientmaterial är inte möjligt eller också skiljer inte ger resultat. Om användning av en annan patientprov eller material (gDNA/cDNA) och olika primers anger fortfarande misslyckas att producera en PCR produkt, möjliga orsaker kan vara att tumör cell bördan är för låg eller att Lymfocytos beror inte på en KLL klon (i vilket fall den immunophenotype bör utvärderas på nytt). Primer som används för analysen bör alltid anges i rapporten kliniska.
Som KLL resultat från ansamling av monoklonal B-celler som bär samma IGHV-IGHD-IGHJ gen omordningen, för de allra flesta fall clonality kommer att bedömning avslöja en unik monoklonala topp, dvs en enda klon. Vid sällsynta tillfällen, kan dubbel omflyttningar eller ens oligoklonala mönster observeras35. I sådana fall gelelektrofores är inte rekommenderad tekniken för clonality bedömning och känsligare metoder såsom fragment analys bör tillämpas. När clonality har bekräftats, avser det sista steget innan sekvensering rening av PCR-produkten att säkerställa att sekvenser av hög kvalitet erhålls. Slutligen, verktyget IMGT/V-QUEST är den resurs som rekommenderas för IG sekvensanalys av ERIC. Som IMGT databaserna uppdateras kontinuerligt och rapportera resultaten på ett konsekvent och väl kommenterad sätt, detta verktyg säkerställer standardiserade analys och underlättar jämförande analys bland olika kliniska eller akademiska faciliteter.
Immunogenetisk analys i KLL har prognostiska och, i synnerhet prediktiva konsekvenser, robust analys av IGHV-IGHD-IGHJ gen omordningen inklusive tilldelningen till stora KLL stereotypa delmängder, är inte längre bara önskvärt men av avgörande betydelse. Detta är särskilt tydligt i denna tid av romanen therapeutics och den potential som IG gen analys har att vägleda behandling beslut5,21,22,23,36,37 ,38, som officiellt anges med den senaste uppdateringen av NCI-sponsrade riktlinjerna från den internationella Workshop på KLL24. Som sagt, stränga normer är motiverade, särskilt som fastställande av SHM status av clonotypic omordnats IGHV gen i patienter med KLL är inte en trivial fråga och innebär en process i flera steg. Viktigast av allt, vissa experimentella åtgärder, främst valet av primers, ger överlägsna resultat när specifika alternativ och/eller strategier följs, andra tekniska aspekter är mottagliga för en viss flexibilitet, såsom val av material eller metod för att bedöma clonality, på grund av att de leder till subtila skillnader, om någon, när det gäller de slutliga resultaten.
Under det senaste årtiondet, har ERIC strävat efter att främja standardisering och harmonisering av olika metoder som är relevanta för KLL diagnostik och förutsägelsen. Detta återspeglas i de utgivna rekommendationer och riktlinjer för immunogenetisk analys27,34, talrika organiserade pedagogiska verkstäder och evenemang, inrättandet av ett IG-nätverk, samt en expert online forum till diskutera och ge vägledning om IG gen sekvens tolkning vid KLL. Det övergripande målet för ERIC genom dessa åtgärder är att främja optimal klinisk hantering och vård. Trots intensiva ansträngningar, denna uppgift är långt ifrån komplett, och i själva verket har blivit mer komplicerad på grund av utvecklingen av romanen hög genomströmning sekvensering som syftar till att immun profilering. Ändå, trots utmaningar kvarstår, intensiva ansträngningar för robust standardiseringen av IG gen analys i KLL fortsätta och är för närvarande i fokus för pågående aktiviteter inom ERIC.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar nuvarande och tidigare medlemmar av våra forskargrupper, IgCLL gruppen och ERIC, för deras engagemang och entusiasm i studerar immunogenetik vid KLL. Vi vill också uppmärksamma i förtroendefullt samarbete med alla ledamöter av initiativet IMGT/KLL-DB och i synnerhet, Professor Marie-Paule Lefranc och Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d’Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, Frankrike, och IMGT, den internationella immunogenetik informationssystemet, för deras enorma stöd och hjälp med IG gen sekvensanalys. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från TRANSCAN-179 roman JTC 2016. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 och särskilda Program molekylär klinisk onkologi-5 promille #9965), Milano, Italien; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rom, Italien; Cancerfonden, Vetenskapsrådet, Knut och Alice Wallenbergs stiftelse, Karolinska Institutet, Uppsala universitet, akademiska sjukhuset och lejonets Cancer Research Foundation, Uppsala; ODYSSEUS-programmet genomförs enligt den ”åtgärder för the strategiska utveckling på the forskning och tekniska sektorn”, finansieras genom det operativa programmet ”konkurrenskraft, entreprenörskap och Innovation” (Strukturfondsstrategin 2014-2020) och medfinansieras av Grekland och Europeiska unionen (Europeiska regionala utvecklingsfonden).
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | – | PCR/Clonality assessment |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
Centrifuge | equipment | ||
PCR machine | equipment | ||
Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |