हम बुलबुले के संपर्क में micromanipulation के लिए एक तकनीक वर्तमान स्थानीयकृत कैल्शियम आयन ढाल का उपयोग कर । एक कैल्शियम आयन समाधान के Microinjection, एक विशाल लिपिड पुटिका के आसपास में, लिपिड झिल्ली remodel करने के लिए उपयोग किया जाता है, झिल्ली ट्यूबलर घुसपैठ के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप.
ऐसी झिल्ली की तस्करी और apoptosis के रूप में मौलिक कोशिका प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता में, कोशिका झिल्ली आकार संक्रमण कैल्शियम आयन एकाग्रता में स्थानीय विविधताओं के साथ समवर्ती हो । इन प्रक्रियाओं में शामिल मुख्य आणविक घटकों की पहचान की गई है; हालांकि, कैल्शियम आयन ढाल और कोशिका झिल्ली के भीतर लिपिड के बीच विशिष्ट पुनरावृत्ति अब तक कम जाना जाता है, मुख्य रूप से जैविक कोशिकाओं की जटिल प्रकृति और अवलोकन योजनाओं की मुश्किल के कारण. इस अंतर को पाटने के लिए, एक सिंथेटिक दृष्टिकोण सफलतापूर्वक कोशिका झिल्ली की नकल पर कैल्शियम आयनों का स्थानीयकृत प्रभाव प्रकट करने के लिए लागू किया गया है । एक सेल के भीतर शर्तों के समान करने के लिए एक नकल की स्थापना एक severalfold समस्या है । सबसे पहले, उचित आयामों और झिल्ली संरचना के साथ एक पर्याप्त biomimetic मॉडल कोशिकाओं के भौतिक गुणों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है । दूसरा, एक micromanipulation सेटअप एक विशेष झिल्ली स्थान पर कैल्शियम आयनों की एक छोटी राशि देने के लिए की जरूरत है । अंत में, एक अवलोकन योजना का पता लगाने और बाहरी उत्तेजना के लिए लिपिड झिल्ली की प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक है । यह लेख कैल्शियम आयन झिल्ली बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत biomimetic दृष्टिकोण प्रदान करता है, जहां एक लिपिड पुटिका प्रणाली, एक विशाल unilamellar पुटिका से मिलकर (गुव) एक multilamellar पुटिका (MLV) से जुड़े, एक स्थानीयकृत कैल्शियम के संपर्क में है एक microinjection प्रणाली का उपयोग ढाल का गठन किया । झिल्ली पर ईओण का प्रभाव की गतिशीलता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया और वीडियो फ्रेम दरों पर दर्ज किया गया । झिल्ली उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में, गुव के अंदर उच्च घुमावदार झिल्ली ट्यूबलर दखलंदाजी (MTPs) का गठन, झिल्ली से दूर उंमुख । वर्णित दृष्टिकोण एक पूरी तरह से संपर्क और नियंत्रित तरीके से लिपिड झिल्ली और एमटीपी उत्पादन के remodeling लाती है । इस दृष्टिकोण का परिचय कैल्शियम आयन झिल्ली बातचीत के विवरण का पता करने के लिए, नए रास्ते प्रदान करने के लिए कोशिका झिल्ली के तंत्र का अध्ययन कर रही है ।
जैविक प्रक्रियाओं के भीतर कैल्शियम आयनों की भूमिका, विशेष रूप से संकेतन में उनकी भागीदारी, कोशिका विभाजन, और झिल्ली संलयन, कई यंत्रवत अध्ययन का ध्यान है1. intracellular cytoplasmic कैल्शियम आयन एकाग्रता १०० एनएम के आदेश पर है, जबकि organelles में कैल्शियम, जैसे कि endoplasmic जालिका, स्रावी बुलबुले, और mitochondria, तक पहुंचने के स्तर को एकाग्रता में millimolars के दसियों । यह खड़ी कैल्शियम आयन एकाग्रता intracellular झिल्ली2,3,4,5,6,7,8 भर में परिमाण के ढाल आदेश बनाता है ,9. extracellular कैल्शियम आयन स्तर के आसपास है 2 मिमी और इसलिए, कैल्शियम आयन एकाग्रता के रूपांतरों दोनों extracellular और intracellular के स्तर पर होते हैं. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से सबूत है कि intracellular कैल्शियम आयन घटनाओं और न्यूरॉन गतिविधि संकेतन extracellular कैल्शियम आयन सांद्रता के स्थानीय उतार चढ़ाव की शर्तों के तहत हो सकता है प्रदान करते हैं, सिंक्रनाइज़ के महत्व का संकेत इंट्रा और extracellular कैल्शियम आयन रूपांतरों10.
कैल्शियम आयनों और जैविक झिल्ली, जिसमें देशी कोशिका झिल्ली लिपिड bilayer बुलबुले के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं सफलतापूर्वक लागू किया गया है एक सिंथेटिक दृष्टिकोण के बीच एक साथ खेलना समझने के लिए लक्ष्य । कैल्शियम आयन समाधान करने के लिए बुलबुले को उजागर लिपिड सिर समूहों और हाइड्रोकार्बन चेन पैकिंग में परिवर्तन करने के लिए सुराग, वृद्धि की झिल्ली तनाव, और पुटिका एकत्रीकरण, साथ ही लिपिड और झिल्ली चरण संक्रमण11,12 के पृथक्करण ,13,14,15,16। कैल्शियम आयनों के लिए जोखिम पर लिपिड झिल्ली के गुण एक्स के रूप में ऐसी प्रयोगात्मक तकनीक का उपयोग कर जांच की गई है-रे, 1ज-एनएमआर, और स्पेक्ट्रोस्कोपी या ऊष्मा अध्ययन11,16, 17 , 18. इन अध्ययनों में, झिल्ली संरचना अक्सर देशी कोशिका झिल्ली के समान है और phosphatidylcholine (पीसी), phosphatidylethanolamine (पीई), और phosphatidylserine (पी एस) के रूप में ऐसे शारीरिक लिपिड शामिल है देखते हैं । पुनश्च कृत्रिम पुटिका तैयारी में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि यह intracellular झिल्ली की तस्करी, exocytosis, और apoptosis19,20सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक आवश्यक घटक है ।
संश्लेषित लिपिड बुलबुले के आकार अक्सर nanometers से कई micrometers के लिए पर्वतमाला । विभिंन पुटिका तैयारी के अलावा, विशाल unilamellar बुलबुले (GUVs), जो व्यास में micrometers के दसियों के लिए कई हैं, विशेष रूप से उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण महत्व के हैं, बारीकी से व्यक्तिगत कोशिकाओं21 के आयामों जैसी , 22 , 23. GUVs की उपलब्ध सतह क्षेत्र का अध्ययन किया जा करने के लिए झिल्ली जैव भौतिक संपत्तियों पर स्थानीय रासायनिक ढाल के प्रभाव को सक्षम बनाता है । बाहरी उत्तेजनाओं के लिए झिल्ली की सतह का केवल एक भाग को उजागर करके, झिल्ली गतिशीलता और अधिक बारीकी से जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि GUVs की सतह के लिए रासायनिक या पीएच ढाल के स्थानीयकृत आवेदन को ट्यूबलर दखलंदाजी के गठन की ओर ले जाता है, जो थोक जोखिम24,25पर नहीं मनाया गया । एकल पुटिका पूछताछ योजनाओं के आगे विधि विकास के लिए झिल्ली व्यवहार कॉल में मनाया मतभेद सेल झिल्ली remodeling के तंत्र में कुछ अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए ।
प्रारंभिक 1900s26,27, से microinjection और micromanipulation के तरीकों पर निर्माण-200023,28 से एकल पुटिका हेरफेर योजनाओं का अधिक हाल ही में प्रगति के संबंध में , इस लेख में एक दृष्टिकोण है जो झिल्ली remodeling और झिल्ली ट्यूबलर दखलंदाजी (MTPs) के गठन गुव झिल्ली में कैल्शियम आयनों के स्थानीय अनुप्रयोग के जवाब में उत्पन्न कर रहे हैं प्रस्तुत करता है ।
हमारे दृष्टिकोण एक पुटिका एक MLV झिल्ली मॉडल प्रणाली (आंकड़ा 1a) के रूप में एक multilamellar पुटिका (biomimetic) से जुड़े गुव से मिलकर जटिल का इस्तेमाल करता है । MLV परिसर के लिए एक लिपिड जलाशय के रूप में एक कैल्शियम आयन ढाल के लिए जोखिम के दौरान गुव को लिपिड सामग्री की आपूर्ति के लिए आवश्यक है । इस संबंध में जटिल के दौरान झिल्ली तनाव में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति करने की अनुमति देता है और गुव झिल्ली के आकार में संक्रमण के लिए प्रेरित और एमटीपी वृद्धि के लिए लिपिड प्रदान करते हैं । इसके अलावा, MLV सतह स्थिरीकरण की सुविधा है क्योंकि इसके द्रव्यमान गुव की तुलना में बड़ा है । गुव-MLV परिसरों, जब एक ठोस सब्सट्रेट पर मैटीरियल, पहले नैनोट्यूब-पुटिका नेटवर्क के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है, बहुलक-झिल्ली बातचीत का अध्ययन, और exocytosis29,30की देर चरणों नकल उतारा, 31,३२,३३.
पिछले प्रोटोकॉल का उपयोग सोयाबीन ध्रुवीय लिपिड निकालने (एसपीई) गुव-MLV परिसरों को तैयार करने के लिए28. एसपीई फॉस्फोलिपिड का एक मिश्रण है कि शामिल पीसी (४५.७%), पीई (२२.१%), phosphatidylinositol (PI, १८.४%), phosphatidic एसिड (फिलीस्तीनी अथॉरिटी, ६.९%), और अंय लिपिड का मिश्रण (६.९%) । हमारे प्रोटोकॉल में, एसपीई मिश्रण 1, 2 के 20% के साथ मैगनीज-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-एल serine (सोडियम नमक) (DOPS) के लिए सेल प्लाज्मा झिल्ली की भीतरी पत्रक नकल है । एक अतिरिक्त 1% एटो 488-1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-डोप) के लिपिड bilayer दाग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर झिल्ली की निगरानी सक्षम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । GUVs bilayer भर सममित लिपिड संरचना है और स्थानीय रूप से 5 कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) के मिमी सांद्रता को उजागर कर रहे हैं । इस तरह के प्रयोगात्मक शर्तों, एक ऊंचा कैल्शियम आयन एकाग्रता के साथ, भी अपोप्तोटिक कोशिकाओं की बाहरी झिल्ली पत्रक की नकल, जहां पुनश्च अणुओं३४व्यक्त कर रहे हैं । गुव-MLV परिसरों के गठन एक संशोधित निर्जलीकरण-निर्जलीकरण विधि शुरू में Criado और केलर३५द्वारा विकसित के उपयोग की आवश्यकता है । पुटिका तैयारी प्रोटोकॉल एक सूखी लिपिड परत है, जो तो समाधान में छोटे बुलबुले के रूप में इस्तेमाल किया जाता है के गठन भी शामिल है । यह समाधान तो निर्जलित और अंतिम गुव-MLV परिसरों के रूप में हाइड्रेटेड है । चित्र 2a -D एक ठेठ गुव-MLV परिसर की तैयारी के लिए मुख्य कदम दिखाता है ।
पुटिका तैयारी पूरा हो गया है और पुटिका परिसर कांच सब्सट्रेट पर मैटीरियल है के बाद, microinjection तकनीक एक खुली टिप ग्लास micropipette के माध्यम से गुव के बाहरी पत्रक के लिए कैल्शियम आयनों की छोटी मात्रा में वितरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कैल्शियम टिप से बाहर समाधान के प्रवाह गुव झिल्ली की सतह पर एक स्थानीयकृत कैल्शियम आयन ढाल उत्पन्न करता है, झिल्ली remodeling और MTPs की पीढ़ी के लिए अग्रणी. MTPs कैल्शियम आयन स्रोत से दूर उंमुख और गुव के अंदर हो जाना कर रहे हैं । इस एमटीपी गठन सीधे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है और एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर दर्ज की गई । चित्रा 3 प्रयोगात्मक झिल्ली reproducing के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया सेटअप से पता चलता है । MTPs के गठन (चित्रा 2E और चित्रा 4) इस प्रोटोकॉल में कैल्शियम आयन जोखिम थोक मात्रा की स्थिति में प्रदर्शन किया प्रयोगों के लिए एक विषम परिणाम दर्शाता है. थोक शर्तों के तहत, GUVs टूटना और फार्म झिल्ली पैच है कि कांच की सतह25का पालन करने के लिए मनाया जा सकता है ।
गुव-MLV परिसरों के गठन पर और अधिक जानकारी, साथ ही साथ कैल्शियम आयनों के microinjection करने के लिए प्रक्रिया, इस लेख में समझाया जाता है । प्रोटोकॉल मोटे तौर पर कैल्शियम आयन microinjection पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं; हालांकि, इस दृष्टिकोण आसानी से अंय आयनों या प्रोटीन के लिए स्थानीय जोखिम के कारण झिल्ली प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, बुलबुले की संरचना को अलग करने के लिए देखते किया जा सकता है की प्रक्रिया में लिपिड घटक भूमिकाओं remodeling । प्रस्तुत प्रोटोकॉल गुव-MLV परिसरों का उत्पादन करने के लिए किसी भी अत्याधुनिक उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और reproducibility के एक उच्च डिग्री की विशेषता है ।
Biomimetic सेल सिस्टम आयनों, प्रोटीन, या नैनोकणों के रूप में बाहरी उत्तेजनाओं के लिए जोखिम पर झिल्ली व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं । GUVs, इस तरह के एक मॉडल जा रहा है, उनके आकार, जो अक्सर ट्यूबलर संरचनाओं और invaginations24,४१,४२,४३ के गठन शामिल है का समायोजन करके रासायनिक वातावरण में परिवर्तन का जवाब कर सकते है .
यह लेख गुव सतह पर कैल्शियम आयनों के स्थानीयकृत इंजेक्शन पर गुव सतह के remodeling के माध्यम से एक संपर्क तरीके में MTPs उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है. प्रोटोकॉल गुव-MLV परिसर, जो एक सेल प्लाज्मा झिल्ली की नकल की तैयारी का वर्णन, साथ ही साथ कैसे एक microinjection तकनीक को रोजगार के लिए कैल्शियम आयन ढाल गुव सतह के करीब उत्पंन करने के लिए MTPs फार्म । पिछले प्रयोगात्मक अध्ययन के बहुमत है कि संबोधित किया कैल्शियम आयन-झिल्ली बातचीत करने के लिए लिपिड बुलबुले उजागर थोक कैल्शियम आयन14,17. प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर, इस तरह के थोक जोखिम कोई ट्यूबलर दखलंदाजी के साथ एक अलग झिल्ली प्रतिक्रिया में परिणाम हो सकता है25का गठन किया ।
गुव-MLV परिसरों के गठन बल्कि सीधा है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण, जैसे कि एक रोटरी वाष्पीकरण, अल्ट्रासोनिक स्नान, और वैक्यूम desiccator की आवश्यकता है । फिर भी, वहां कई महत्वपूर्ण कदम पुटिका तैयारी के दौरान विचार कर रहे हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि बुलबुले के निर्जलीकरण (प्रोटोकॉल के २.३ कदम के दौरान) पूरा हो गया है और एक सूखी परिपत्र लिपिड केवल नमक क्रिस्टल की एक छोटी राशि से युक्त फिल्म कांच कवर स्लिप की सतह पर बनाई गई है । प्रयोग के दौरान, पुटिका समाधान के सावधान हैंडलिंग, क्लोरोफॉर्म में ताजा लिपिड स्टॉक समाधान का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह के रूप में ताजा HEPES बफर, गुव-MLV परिसरों की सफल तैयारी के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, गुव-MLV परिसर के कांच कवर पर्ची सतह के सुरक्षित लगाव micromanipulation और microinjection के लिए महत्वपूर्ण है । गुव-MLV परिसर के पर्याप्त आसंजन की पुष्टि करने के लिए, micropipette (इंजेक्शन प्रवाह के बिना) धीरे गुव सतह के खिलाफ धक्का करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक दृढ़ता से पालन पुटिका सीधे शारीरिक संपर्क पर सतह के साथ स्लाइड नहीं होगा । प्रयोगों एक खुले बफर छोटी बूंद में किया जाता है, जो कई घंटे के लिए पूछताछ की जा सकती है, वाष्पीकरण को ध्यान में रखा जाना चाहिए. बफर छोटी बूंद से वाष्पीकरण को प्रभावित और बुलबुले को अस्थिर कर सकता है जो आसमाटिक शर्तों, बदल जाएगा । आसमाटिक शर्तों को पुनर्स्थापित करने के लिए, मूल वॉल्यूम को पुनर्स्थापित करने के लिए नमूने के लिए शुद्ध पानी के आवधिक अतिरिक्त homeostasis करने के लिए सिस्टम देता है ।
जब लिपिड झिल्ली संरचना को संशोधित करने, यह महत्वपूर्ण है कि बुलबुले एक गुव-MLV जटिल के रूप में उत्पादित कर रहे हैं क्योंकि MLV झिल्ली को आकार देने के दौरान गुव के लिए लिपिड सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि शुद्ध लिपिड के साथ एसपीई मिश्रण के घटकों की जगह, या कोलेस्ट्रॉल के 5-30% जोड़ने, भी गुव के लिए अनुमति देता है-MLV जटिल गठन28,४४. तैयार GUVs का बहुमत unilamellar४५है ।
इसके अलावा, जब इस तरह के मैग्नीशियम आयनों के रूप में अंय divalent cations, परीक्षण, MTPs के गठन भारी लिपिड मिश्रण में नकारात्मक आरोप लगाया DOPS की उपस्थिति पर निर्भर करता है । DOPS के बिना, MTPs इस प्रोटोकॉल में वर्णित बुलबुले में फार्म नहीं है । इसके अलावा, पोटेशियम और सोडियम के रूप में monovalent cations, MTPs के गठन में परिणाम नहीं है, यहां तक कि DOPS-युक्त बुलबुले25.
तैयारी और GUVs के हेरफेर के संबंध में महत्वपूर्ण कदम के अलावा, वहां कई महत्वपूर्ण कारकों को microinjection प्रक्रिया के दौरान विचार कर रहे हैं । कैल्शियम आयनों के सफल microinjection के प्रयोग के दिन पर तैयार कर रहे हैं, जो ठीक से काम कर कांच micropipettes, पर निर्भर करता है । कई कारकों है कि micropipette खराबी के कारण सकता है । एक आम कारण एक भरा टिप खोलने है । छोटे लिपिड कणों, जो पुटिका तैयारी के शोधकार्य कर रहे हैं, समाधान में फैला रहे हैं और micropipette टिप का पालन करने के लिए करते हैं, जिससे एक कॉलेस्ट्रॉल पैदा. सफाई पिपेट टिप सबसे अच्छा यह पुटिका समाधान से ऊपर उठाने और इसे वापस गुव सतह के करीब रखने के द्वारा किया जाता है । क्योंकि यह भारी समाधान में कैल्शियम आयनों के बड़े पैमाने पर इंजेक्शन में परिणाम microinjection पंप का झटका बाहर समारोह के उपयोग से बचा जाना चाहिए । इसके अलावा, छोटे हवाई बुलबुले micropipette अंदर फंस उचित microinjection को रोकने के लिए, जो मामले में micropipette एक नया एक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । टिप टूटना काफी टिप दोलनों को कम करने के लिए एक कंपन-भीगा मेज पर प्रयोगात्मक सेटअप रखने से कम किया जा सकता है ।
इसके अलावा, देखभाल की जरूरत है जब एक अवलोकन योजना का चयन करने के लिए, सबसे अच्छा समय-हल छवियों को प्राप्त करने photobleaching whilst कम करने के लिए लिया जाना चाहिए । वाइड क्षेत्र लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया गया था क्योंकि यह एक उद्देश्य सीमित जांच गहराई में एक अपेक्षाकृत उच्च छवि अधिग्रहण दर के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, उल्टे माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक साथ microinjection और लिपिड बुलबुले और MTPs के अवलोकन के लिए अनुमति देता है ।
प्रस्तुत विधि की मुख्य सीमाओं में से एक व्यापक मैनुअल काम और पर्याप्त micromanipulation कौशल की आवश्यकता है । क्योंकि परिसरों में एक सहज सूजन की प्रक्रिया के माध्यम से गठन कर रहे हैं, GUVs और MLVs के आकार को नियंत्रित नहीं किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल को तैयार गुव-MLV परिसरों की झिल्ली तनाव के नियंत्रण के लिए अनुमति नहीं है, जो झिल्ली remodeling के संबंध में अतिरिक्त विवरण इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हो सकता है । GUVs MTPs की पर्याप्त वृद्धि के लिए एक हद तक है कि केवल GUVs से उपलब्ध झिल्ली का उपयोग प्राप्त करने के लिए असंभव होगा बाद की आपूर्ति के साथ MLVs से जुड़े रहे हैं । MLVs भी गुव-MLV जटिल४४है, जो micropipette आकांक्षा का उपयोग करके पुटिका के तनाव को नियंत्रित करने का प्रयास जटिल होगा भीतर किसी भी पार्श्व सतह तनाव विविधताओं को कम करने में योगदान । यह गुव-MLV-आधारित मॉडल एक कम तनाव प्रदान करता है जो बेहतर ढंग से झिल्ली के जलाशयों, जैसे झिल्ली परतों और invaginations४६से जुड़ा सेलुलर झिल्ली संरचनाओं में पाया तनाव शासनों की नकल करती है । एक ही समय में, micropipette आकांक्षा तकनीक सफलतापूर्वक एकल GUVs में झिल्ली तनाव को नियंत्रित करने के लिए लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, पकड़ो एट अल द्वारा काम के लिए एक GUVs में झिल्ली ट्यूबलर invaginations के गठन पर विवरण प्रदान की झिल्ली को कैल्शियम आयनों के विभिंन तनाव से भारी स्थितियों में४०सरकारों पर बाध्यकारी । अंत में, दोनों स्थानीय और थोक कैल्शियम के लिए जोखिम पर झिल्ली व्यवहार की तुलना सतह, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है के लिए झिल्ली आसंजन के नियंत्रण में सुधार की आवश्यकता है ।
संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, प्रस्तावित तकनीक के लिए अनुमति देता है संपर्क करने के लिए और कैल्शियम आयनों के साथ स्थानीयकृत उत्तेजना पर MTPs के गठन के लिए । इस विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए सिंथेटिक पुटिका प्रणालियों से अनुवाद पर केंद्र देशी जैविक झिल्ली, जैसे कोशिका blebs. प्रस्तावित विधि अन्य एकल सेल पूछताछ योजनाओं के साथ शामिल किया जा सकता है, जैसे पैच दबाना या microelectrode amperometry, या स्थानीयकृत हीटिंग रणनीतियों के साथ संयुक्त31,४७,४८. अंय आयनों या अणुओं के प्रभाव का परीक्षण सीधा है और केवल ब्याज के अणुओं के साथ कैल्शियम आयनों की जगह शामिल है । इसके अलावा, जटिल सिंथेटिक लिपिड बुलबुले transmembrane प्रोटीन के साथ झिल्ली functionalization के माध्यम से उत्पादन किया जा सकता है, जो सेल को आकार देने और कोशिका झिल्ली गतिशीलता के संवेदन के साथ जुड़े की हमारी समझ का विस्तार हो सकता है स्थानीय रासायनिक ढाल । पिछले नहीं बल्कि कम, लिपिड झिल्ली के संपर्क में उत्तेजना भी बहुलक नरम बात प्रणालियों के लिए अनुवाद किया जा सकता है, एक उपंयास संपर्क हेरफेर मंच के लिए एक आधार की पेशकश की ।
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |